Общие свойства ферментов какие опыты позволяют их обнаружить

Ферменты – биологические катализаторы белковой природы. Они значительно повышают скорость химических реакций, которые в отсутствие ферментов протекают очень медленно. При этом ферменты не расходуются и не претерпевают необратимых изменений.

Каким образом ферменты повышают скорость реакций? Они ускоряют химические реакции, находя “обходные пути”, позволяющие молекулам преодолевать активационный барьер на более низком энергетическом уровне. Это становится возможным потому, что ферментативная реакция состоит из 2-х стадий: на первой стадии происходит образование фермент-субстратного комплекса, переходному состоянию которого соответствует значительно более низкая энергия активации; на второй стадии этот комплекс распадается на продукты реакции и свободный фермент, который может взаимодействовать с новой молекулой субстрата. Это можно выразить следующим уравнением:

E + S ↔ ES → P + E

где E – фермент, S – субстрат, ES – фермент-субстратный комплекс, P – продукты реакции.

Особенности ферментов.Ферменты, являясь по своей природе белками, обладающими третичной или четвертичной структурой, имеют ряд особенностей, которые отличают их от неорганических катализаторов.

В первую очередь, это огромная сила каталитического действия. Ферменты в 108- 1020 раз повышают скорость катализируемых ими реакций. Во-вторых, это специфичность действия ферментов. Они катализируют строго определенные реакции. Только

благодаря тончайшей специфичности ферментативного катализа возможна строгая упорядоченность и теснейшая взаимосвязь отдельных ферментативных реакций, лежащих в основе биологического обмена веществ.

По степени специфичности отдельные ферменты довольно сильно различаются между собой. Выделяют следующие основные типы специфичности:

– абсолютная специфичность – фермент катализирует превращение только одного субстрата;

– групповая специфичность – фермент действует на группу родственных субстратов, обладающих определенными структурными особенностями;

– специфичность по отношению к определенным типам реакций – такие ферменты обнаруживают наименьшую специфичность, они действуют независимо оттого, какие группы присутствуют вблизи той связи, на которую направлено действие фермента;

– стереохимическая специфичность – фермент катализирует превращение только одной стереохимической формы субстрата.

Третьей особенностью ферментов, как биологических катализаторов, является их лабильность. Они подвержены влиянию различных факторов и могут изменять свою активность под действием рН, температуры, присутствия активаторов и ингибиторов и др. Лабильность (или, иными словами, изменчивость) ферментов обусловлена их белковой природой, сложной пространственной конфигурацией (структурой).

Влияние этих факторов на активность ферментов и скорость катализируемых ими реакций будет рассмотрена в разделе кинетики.

Многие ферменты являются двухкомпонентными, то есть состоят из белковой части – апофермента и связанного с ним небелкового компонента – кофермента, участвующего в действии фермента в качестве обязательного кофактора. В результате ферментативных реакций коферменты, как правило, не подвергаются изменениям, однако при ряде последовательно протекающих реакций кофермент может представлять собой субстрат для отдельных ферментов, хотя и регенерируется в конечном счете в исходной форме.

Химическая природа коферментов, их функции в ферментативных реакциях и механизм действия чрезвычайно разнообразны. Так, например, в качестве коферментов могут выступать витамины и их производные.

В соответствии с химическим строением коферменты можно подразделить на следующие группы: а) коферменты алифатического ряда (глутатион, липоевая кислота); б) коферменты ароматического ряда (коэнзим Q – убихинон); в) коферменты – гетероциклические соединения (производные витаминов B6, B1, биотина – витамина H, производные

фолиевой кислоты); г) коферменты – нуклеотиды и нуклеозиды (коэн-зим А, НАД/НАДО, ФАД/ФАДФ).

Единицы активности ферментов.Любой ферментный препарат прежде всего должен быть охарактеризован по его ферментативной активности. Комиссия по ферментам Международного Биохимического Союза рекомендует использовать следующие понятия и выражения единиц активности ферментов.

– Стандартная единица фермента – это такое количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля данного субстрата за одну минуту при заданных условиях. Стандартная единица фермента обозначается буквой E (от русского слова “единица”) или буквой U (от английского слова “unit”).

– Уд ельная активность- это число единиц (E или U), отнесенное к одному миллиграмму белка в ферментном препарате. Количество белка в препарате фермента может быть определено любым известным методом определения белка (метод Кьельдаля, метод Лоури и др.).

– Молекулярная активность – число молекул данного субстрата или эквивалентов затронутых групп, превращаемых за одну минуту одной молекулой фермента при оптимальной концентрации субстрата. Это понятие соответствует числу оборотов, введенных Варбургом. Число оборотов по Варбургу – это число молей превращенного субстрата, приходящееся на моль фермента за минуту. Для определения молекулярной активности фермента нужно знать его молекулярную массу.

– Катал – каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью равной 1 молю в секунду в заданной системе измерения активности. Каталитическая активность в 1 катал (кат) при практическом применении оказывается слишком большой величиной, по этому в большинстве случаев каталитические активности выражают в микрокаталах (мккат), нанокаталах (нкат) или пикокаталах (пкат). Стандартная единица фермента находится с каталом в следующем соотношении: 1 E (U) = 16,67 нкат.

279 :: 280 :: 281 :: Содержание

281 :: 282 :: 283 :: 284 :: 285 :: 286 :: 287 :: 288 :: 289 :: 290 :: 291 :: 292 :: 293 :: 294 :: 295 :: Содержание

Источник

В настоящее время многие отрасли промышленности – хлебопечение, виноделие, пивоварение, производство спирта, сыроделие, производство органических кислот, чая, аминокислот, витаминов, антибиотиков – основаны на использовании различных ферментативных процессов.

Однако работа с ферментами, их использование требуют элементарной грамотности в вопросах ферментативной кинетики и способах регуляции ферментативной активности. Кроме того, необходимо всегда учитывать наличие в сырье собственных эндогенных ферментов, которые в процессе приготовления пищевых продуктов могут оказывать различное действие (как положительное, так и отрицательное).

Ферменты – биологические катализаторы, ускоряющие химические реакции обмена веществ в организме.

Механизм действия ферментов состоит в снижении энергии активации, необходимой молекуле, чтобы вступить в реакцию. Снижение энергии активации происходит в результате образования промежуточного нестойкого соединения – фермент-субстратного комплекса, что вызывает глубокую деформацию разрываемой связи. При этом фермент является начальным фактором; в дальнейшем катализируемая им реакция идет уже самостоятельно, этим объясняется тот факт, что для ферментативной реакции достаточно незначительная концентрация фермента.

Ферментативная реакция состоит из 2-х стадий: на первой стадии происходит образование фермент-субстратного комплекса, переходному состоянию которого соответствует значительно более низкая энергия активации; на второй стадии этот комплекс распадается на продукты реакции и свободный фермент, который может взаимодействовать с новой молекулой субстрата. Это можно выразить следующим уравнением:

Е + S ↔ ES → P + E,

(3.1)

где Е – фермент; S – субстрат; ES – фермент-субстратный комплекс; Р – продукты реакции.

В процессе ферментативной реакции различают 4 этапа:

1 – присоединение молекулы субстрат к ферменту и образование фермент-субстратного комплекса;

2 – изменение субстрата под действием фермента, делающее его доступным для химической реакции, т.е. активизация субстрата;

3 – химическая реакция;

4 – отделение продуктов реакции от фермента.

На 1-ом этапе к субстратному центру присоединяется с помощью слабых взаимодействий та часть молекулы субстрата, которая не подвергается химическим превращениям. Для образования фермент-субстратного комплекса (ES) необходимо соблюдение трех условий, которые и определяют высокую специфичность действия фермента.

Условия образования фермент-субстратного комплекса:

1 – структурное соответствие между субстратом и активным центром фермента.

2 – электростатическое соответствие активного центра фермента и субстрата, которое обусловлено взаимодействием противоположно заряженных групп.

3 – гибкость третичной структуры фермента – «индуцированное соответствие».

Ферменты, являясь по своей природе белками, обладающими третичной или четвертичной структурой, имеют ряд особенностей, которые отличают их от неорганических катализаторов.

В первую очередь, это огромная сила каталитического действия. Ферменты в 108 – 1020 раз повышают скорость катализируемых ими реакций. Так, энергия активации разложения Н2О2 без катализатора составляет 75,6 кДж/моль, в присутствии неорганического катализатора (коллоидной платины) – 48,14 кДж/моль и скорость ее увеличивается в 2х104 раз. В присутствии фермента каталазы энергия активации разложения Н2О2 снижается до 23,1 кДж, а скорость реакции увеличивается в 2х1011 раз.

Во-вторых, это специфичность действия ферментов. Способность фермента катализировать определенный тип реакции называют специфичностью.

Специфичность бывает трех видов:

1 – относительная или групповая специфичность – фермент действует на определенный вид химической связи (например, фермент пепсин расщепляет пептидную связь);

2 – абсолютная специфичность –фермент действует только на один строго определенный субстрат (например, фермент уреаза расщепляет амидную связь только в мочевине);

3 –стехиометрическая специфичность – фермент действует только на один из стереоизомеров (например, фермент глюкозидаза сбраживает только D-глюкозу, но не действует на L-глюкозу).

Специфичность фермента обеспечивает упорядоченность протекания реакций обмена веществ.

Третьей особенностью ферментов является лабильность. Они подвержены влиянию различных факторов и могут изменять свою активность под действием рН, температуры, присутствия активаторов и ингибиторов и др.

Источник

· Получите ферментативный препарат амилазы слюны (ополоскать рот водой, затем набирать 10-20 мл дистиллированной воды, выдержать во рту 2-3 мин и полученный раствор амилазы слить в стакан);

· В две пробирки налейте по 10 капель раствора крахмала, подпишите пробирки контрольиопыт;

· В контрольную пробирку налейте 5 капель воды, в опытную – 5 капель амилазы слюны;

· Перемешайте и поставьте в термостат при 370С на 15 мин;

· Затем опытную пробирку разделите пополам, отливая половину содержимого в чистую пробирку;

· В одну пробирку добавьте 1 каплю йода, в другую добавьте 1 каплю сульфата меди и 4 капли гидрооксида меди и нагрейте до кипения (реакция Троммера);

· Аналогичные реакции проведите с контрольной пробиркой;

· Отметьте изменение окраски и данные занесите в таблицу.

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом	Реакция Троммера

Опыт № 2. Специфичность действия ферментов.

· В две пробирки налейте по 10 капель раствора слюны, в первую добавьте 10 капель раствора крахмала, во вторую – 10 капель сахарозы;

· Пробы перемешайте и поместите в термостат при 370С на 15 мин;

· Затем первую пробирку разделите пополам, отливая половину содержимого в чистую пробирку, и проделайте две реакции: пробу Троммера и реакцию с йодом;

· Со второй пробиркой проделайте реакцию Троммера;

· Отметьте изменение окраски и данные занесите в таблицу.

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом	Реакция Троммера

Ответьте на вопросы:

1. Напишите реакцию, которую катализирует амилаза слюны.

2. Назовите субстраты амилазы.

3. Для чего необходима инкубация фермента с субстратом?

4. Какой специфичностью обладает амилаза слюны?

5. Как можно измерить активность амилазы?

6. Дайте определения следующим понятиям: фермент, активный центр, аллостерический центр, простые ферменты, сложные ферменты, апофермент, кофермент, холофермент, обратимость действия, термолабильность, специфичность.

Практическая работа

«Зависимость активности ферментов от рН среды».

Цели практической работы:

· закрепить знания о свойствах ферментов, кинетике ферментативных реакций, классификации ферментов по сложности строения;

· научиться определять зависимость активности амилазы слюны от рН среды.

Задание для самостоятельной работы:

1. Законспектируйте методику проведения практической работы.

2. Подготовьте рабочее место для исследования.

3. Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от рН среды.

4. Сделайте выводы по работе и рисунки.

5. Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Для амилазы слюны оптимальное значение рН лежит в пределах слабощелочной среды, в кислой и сильно щелочной среде активность фермента снижается, и расщепление крахмала происходит не полностью, до стадии декстринов, которые с йодом дают красно-фиолетовое или красно-бурое окрашивание.

Реактивы:
1. 1% раствор крахмала.
2. 1% раствор йода.
3. фосфатно-цитратный буфер с рН 5.0, 5.4, 6.8, 8.0, 10.0.
4. Амилаза слюны.

Оборудование:
1. Штатив с пробирками (5 шт).
2. Пипетки на 1 мл, глазные пипетки.
3. Термостат.

Ход работы:

· В 5 пронумерованных пробирок налейте по 1 мл фосфатно-цитратного буфера со значением рН 5.0, 5.4, 6.8, 8.0, 10.0;

· Во все пробирки добавьте по 1 мл 1% раствора крахмала и по 1 мл раствора амилазы;

· Затем во все пробирки добавьте по 3 капли раствора йода, тщательно перемешайте;

· Все пробирки поместите в термостат при 370С на 15 мин;

· Затем пробирки охладите под холодной водой и сравнит окраску во всех 5 пробирках;

· Сделайте вывод о зависимости активности амилазы от рН среды.

Ответьте на вопросы:

1. Приведите примеры простых ферментов.

2. Приведите примеры сложных ферментов.

3. Перечислите факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.

4. *Назовите оптимальную рН для следующих ферментов: пепсин, химозин, гастриксин, амилаза слюны, трипсин, липаза, химотрипсин.

Практическая работа

«Зависимость активности ферментов от температуры».

Цели практической работы:

· закрепить знания о кинетике ферментативной реакции;

· научиться определять зависимость активности амилазы слюны от температуры.

Задание для самостоятельной работы:

· Законспектируйте методику проведения практической работы.

· Подготовьте рабочее место для исследования.

· Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от температуры.

· Сделайте выводы по работе, по полученным результатам построить график зависимости активности амилазы от температуры.

· Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Все ферменты являются термолабильными веществами и проявляют свою максимальную активность при 370С. При снижении или повышении температуры активность ферментов падает, что приводит к образованию промежуточных продуктов или к полной остановке реакции. Так, нерасщепленный крахмал дает с йодом синее окрашивание, а декстрины (промежуточные продукты распада крахмала) в зависимости от величины своих частиц дают с йодом фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску. Таким образом, по окраске раствора йодом можно судить о степени гидролиза крахмала.

Реактивы:
1. 1% раствор крахмала.
2. 1% раствор йода.
3. Раствор амилазы.
4. Дистиллированная вода.

Оборудование:
1. Штатив с пробирками (4 шт).
2. Пипетки на 1 и 2 мл, глазные пипетки.
3. Термостат.
4. Водяная баня.
5. Ледяная баня.
6. Спиртовка.

Ход работы:

· В четыре пронумерованной пробирки налейте по 0,5 мл раствора амилазы;

· Пробирку №1 поставьте в лед, №2 – оставьте при комнатной температуре, №3 – в термостат, №4 – в кипящую водяную баню;

· Через 5 мин, когда содержимое пробирок примет нужную температуру, в пробирку №1 добавьте 2 мл крахмала, охлажденного до температуры тающего льда.

· Во 2-ю,3-ю и 4-ю пробирки добавьте по 2 мл раствора крахмала комнатной температуры;

· Во все пробирки добавьте по 2 капли йода;

· Перемешайте содержимое и поместите пробирки в те же самые условия на 15 мин;

· Затем пробирки достаньте, охладите, и оцените активность амилазы по интенсивности и цвету окраски;

· Результаты занесите в таблицу:

№	Субстрат	Фермент	t	Реакция с йодом
1.
2.
3.
4.

Ответьте на вопросы:

1. Перечислите основные свойства ферментов.

2. Как влияет температура на активность ферментов?

3. К какому классу ферментов относится амилаза слюны?

4. Перечислите классы ферментов с примерами.

5*. Нарисуйте графики зависимости активности ферментов от температуры, рН, концентрации S и Р.

Практическая работа

«Зависимость активности ферментов от влияния активаторов и ингибиторов».

Цели практической работы:

· закрепить знания об активаторах и ингибиторах, видах ингибирования;

· научиться определять зависимость активности амилазы слюны от влияния активаторов и ингибиторов.

Задание для самостоятельной работы:

1. Законспектируйте методику.

2. Подготовьте рабочее место для исследования.

3. Проведите определение зависимости активности амилазы слюны от влияния активаторов и ингибиторов.

4. Сделайте выводы по работе и рисунки.

5. Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Активаторы и ингибиторы влияют на активный центр фермента, способствуя его активации или ингибированию.

Реактивы:
1. 1% раствор крахмала.
2. 1% раствор йода.
3. 1% раствор сульфата меди.
4. 1% раствор хлорида натрия.
5. Амилаза слюны.
6. Дистиллированная вода.

Оборудование:
1. Штатив с пробирками (3).
2. Пипетки глазные.
3. Стаканчики.
4. Воронка.

Ход работы:

· В 3 пронумерованные пробирки налейте по 10 капель раствора амилазы;

· Затем по одной капле добавьте в 1-ю – хлорид натрия, во 2-ю – сульфат меди, в 3-ю – воды (контроль).

· Перемешайте, внесите в каждую пробирку по 5 капель раствора крахмала и оставьте стоять на 3 мин при комнатной температуре.

· Затем добавьте по 1 капле йода, перемешайте, наблюдайте за окраской растворов и определите, в какой пробирке действовал активатор или ингибитор.

· Результаты оформите в виде таблицы:

№	Субстрат	Фермент	Реакция с йодом в присутствии
СuSO4	NaCI	H2O
1.
2.
3.

Ответьте на вопросы:

1. Дайте определения и характеристику изоферментам на примере ЛДГ и КК.

2. Дайте определение следующим терминам: активаторы, ингибиторы, денатурация, ингибирование.

3. Перечислите основные виды ингибирования.

4. Объясните принцип конкурентного ингибирования.

5. *Ингибитор снижает активность фермента до 30% от исходного уровня. Повышение концентрации субстрата катализируемой реакции восстанавливает 80% активности фермента. К какому типу относится данный ингибитор?

Практическая работа

«Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови».

Цели практической работы:

· усвоить представление о диагностическом значении определения ферментов;

· изучить клинико-диагностическое значение определения амилазы в сыворотке крови и моче;

· научиться определять активность панкреатической альфа-амилазы в сыворотке крови.

Задания для самостоятельной работы:

1. Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.

2. Оборудуйте рабочее место для практической работы.

3. Выполните практическую работу.

4. Сделайте необходимые расчеты.

5. Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.

6. Сделайте вывод по работе и рисунки.

7. Ответьте на дополнительные вопросы.

Принцип:

Альфа-амилаза гидролизует крахмал с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски.

Реактивы:
1. Крахмал-субстрат.
2. Фосфатный буфер рН=7.
3. Раствор йода 0,01н.
4. Вода дистиллированная.
5. Сыворотка крови.

Оборудование:
1. Штатив с пробирками (2 шт).
2. Пипетки на 1 мл, 5 мл.
3. Дозатор на 0,01 мл и на 0,5 мл.
4. Термостат.
5. ФЭК.

Ход определения:

Проведите исследование активности амилазы в сыворотке крови согласно таблице.

Реактивы.	Опытная проба, мл.	Холостая проба, мл.
Рабочий реактив	0.5	0.5
Выдержать в термостате при 370С в течение 5 мин.
Сыворотка крови	0.01	–
Вода дистиллированная	–	0.01
Выдержать в термостате при 37°С в течение 7,5 мин. Время инкубации строго отсчитывать по секундомеру от момента внесения образца и затем сразу добавить:
Раствор йода	0.5	0.5
Объем проб довести дистиллированной водой до 5 мл, перемешать и измерить оптическую плотность опытной пробы (А1) и холостой пробы (А2) против дистиллированной воды, при 630-690 нм в кювете на 10 мм.

Расчет проводим по формуле:

Активность амилазы = (А2 – А1)* 44.4/А2, мг/с*л

Активность амилазы показывает количество крахмала в мг, гидролизованного 1л биологической жидкости за 1с при 37 С.

Норма активности амилазы:

Сыворотка крови – 3.3 –8.9 мг/с*л или 16-30 г/ч*л.

Моча – до 44 мг/с*л или 20 –160 г/ч*л.

Дата добавления: 2016-11-02; просмотров: 1724 | Нарушение авторских прав | Изречения для студентов