На каком свойстве ферментов основано определение их активности

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы определения активности ферментов, которые основаны на определении скорости превращения субстратов для действия энзимов в соответствующие продукты ферментативной реакции, которые они катализируют.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение активности                                ОФС.1.2.4.0013.15

ферментных препаратов                        Взамен ГФ XI, вып.2, стр. 25

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы определения активности ферментов, которые основаны на определении скорости превращения субстратов для действия энзимов в соответствующие продукты ферментативной реакции, которые они катализируют.

Классификация ферментов

Фермент (E) – белок, обладающий каталитическими свойствами в реакции преобразования субстрата (S) в продукт (P).

Согласно международной номенклатуре (табл.), все ферменты подразделяются на 6 классов в зависимости от типа катализируемых ими реакций.

Таблица – Классификация ферментов

Особенности измерения активности ферментов, описываемые в фармакопейных статьях, определяется их принадлежностью к тому или иному классу.

Принцип, положенный в основу всех методов определения активности фермента (Е), заключается в регистрации скорости убыли субстрата (S) (то есть вещества, на которое действует фермент) или скорости образования продукта реакции (P).

Простейшей схемой для описания кинетики ферментативных реакций является так называемая двухстадийная схема:

(1)

где:   Е     –     фермент;

S     –     субстрат;

P     –     продукты реакции;

kкат    –     каталитическая константа.

Начальная скорость (υo) катализируемой ферментом реакции, при которой расходом субстрата можно пренебречь, описывается уравнением Михаэлиса–Ментен (2):

где:

Vмакс = kкат ×  [E]0   — максимальная скорость реакции;

[E]0  –        начальная концентрация фермента;

Kм     –        константа Михаэлиса.

Для аллостерических ферментов начальная скорость ферментативной реакции не подчиняется уравнению Михаэлиса–Ментен.

Для определения скорости ферментативной реакции через определенные промежутки времени отбирают пробы из реакционной смеси и проводят количественное определение методами, основанными чаще всего на спектральных свойствах субстрата или продукта реакции.

Требования к условиям проведения ферментативной реакции

Ферментативная реакция должна проводиться в строго определенных условиях с учетом следующих факторов.

1. Начальная скорость реакции (υo). Скорость ферментативной реакции количественно можно измерить по убыли субстрата или по образованию продукта реакции.

Типичные кинетические кривые ферментативной реакции приведены на рис. 1. Для каждой ферментативной реакции могут быть подобраны условия, при которых начальный участок кривой линеен, т. е. зависимость концентрации образовавшегося продукта или израсходованного субстрата от времени наблюдения имеет прямо пропорциональный характер.

Рисунок 1 – Типичные кинетические кривые ферментативной реакции:

А – регистрация по скорости исчезновения субстрата реакции;

Б – регистрация по скорости образования продукта реакции

Начальная скорость реакции (υo) определяется как тангенс угла наклона линейного участка кривой.

Поскольку длительность прямолинейного участка кинетической кривой от опыта к опыту несколько изменяется, время инкубации (при использовании метода отбора проб) должно составлять не более 70 % и не менее 20% времени соответствующего прямолинейного участка.

2. Концентрация субстрата ([S]0). В большинстве случаев зависимость начальной скорости ферментативной реакции (υo) от начальной концентрации субстрата ([S]0), согласно уравнению Михаэлиса–Ментен (2) описывается гиперболической функцией (рис. 2).

Начальная скорость реакции (υo) зависит от начальной концентрации субстрата ([S]0) вплоть до его насыщающей концентрации. Под насыщающей концентрацией ([S]нас) понимают такую концентрацию субстрата, при которой начальная скорость реакции практически перестает повышаться при дальнейшем увеличении концентрации субстрата, стремясь к своему предельному значению, называемому максимальной скоростью реакции Vмакс (рис. 2). Отрезок на оси абсцисс, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет представлять собой Км. При проведении ферментативной реакции реакционная смесь должна содержать такое количество субстрата, которое обеспечит насыщение фермента в течение всего хода определения (количество субстрата, взятого для проведения ферментативной реакции, должно быть примерно на 30% выше насыщающей концентрации).

Если форма кривой зависимости начальной скорости реакции (υo) от начальной концентрации субстрата ([S]0) отличается от гиперболической, определение параметров по уравнению Михаэлиса–Ментен невозможно. Такие отклонения наблюдаются в случае ингибирования или активации фермента субстратом, а также при работе с аллостерическими ферментами. В этом случае оптимальной является та концентрация субстрата, при которой начальная скорость реакции максимальна ([S]опт)– точка перегиба на экспериментальной кривой зависимости начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата (рис. 2).

После выбора насыщающей концентрации субстрата необходимо проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [P] от t.

В качестве субстратов используются как природные вещества, такие как альбумин, казеин, крахмал, так и синтетические. Природные субстраты ферментов используют большей частью для подтверждения подлинности. Синтетические субстраты обеспечивают более высокую точность и лучшую воспроизводимость при количественном определении ферментативной активности.

3. Концентрация фермента ([Е]0). В соответствии с уравнением Михаэлиса–Ментен начальная скорость ферментативной реакции (υo) в подавляющем большинстве случаев линейно зависит от концентрации фермента ([E]0). Выбор оптимальной для каждого метода концентрации фермента осуществляется экспериментально при помощи построения кривой зависимости начальной скорости реакции от концентрации фермента (рис. 3).

После выбора начальной концентрации фермента необходимо проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [P] от t при выбранном значении насыщающей концентрации субстрата.

4. Температура. Особенностью ферментативных реакций является наличие колоколообразной зависимости скорости реакции от температуры в достаточно широком интервале температур, которая характеризуется «температурным оптимумом» реакции. Эта особенность объясняется наложением 2 эффектов: возрастанием скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при достаточно высоких температурах. Обычно ферментативную реакцию рекомендуется проводить в термостате при температуре (37 ± 0,1) ºС, если нет иных указаний в фармакопейной статье. Предварительно каждый из реагентов нагревают до температуры 37º С.
5. Значение рН. Типичная кривая, описывающая для большинства ферментов рН-зависимость начальной скорости ферментативной реакции при наличии 2 ионогенных групп в активном центре фермента, приведена на рис. 4.

Определение активности следует проводить при оптимальном значении рН, определенном при выбранных значениях концентрации фермента и насыщающей концентрации субстрата; использовании буферного раствора того состава, который не ингибирует фермент и температуре (37 ± 0,1) ºС, если нет других указаний в фармакопейной статье.

После выбора оптимального значения рН необходимо проверить, сохраняется ли при этом рН линейная зависимость [P] от t при выбранных значениях концентрации фермента и насыщающей концентрации субстрата.Рисунок 4 – Зависимость начальной скорости реакции υ0 от значения рН

6. Кофакторы. Существуют ферменты, для проявления каталитических свойств которых необходимо присутствие кофакторов – веществ, с помощью которых происходит активация ферментов. Кофакторами могут выступать один или несколько неорганических ионов, таких как Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ или комплексная органическая или металлорганическая молекула, называемая коферментом.

Для определения оптимальной концентрации кофактора следует построить кривую зависимости начальной скорости реакции от начальной концентрации кофактора, аналогичную зависимости начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата, и по этой кривой выбрать насыщающую концентрацию кофактора.

После выбора насыщающей концентрации кофактора необходимо проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [P] от t.

Конкретные параметры ферментативной реакции указываются в фармакопейных статьях.

Способы детекции

Для количественной регистрации скорости ферментативной реакции используют спектрофотометрические, флюресцентные, хеми- и биолюминесцентные методы детекции, основанные на спектральных свойствах субстрата или продукта реакции, а также детекцию с помощью микрокалориметрических датчиков и биодатчиков (биосенсоров) на основе хеми- и биолюминесценции; электрохимические методы, такие как потенциометрия, амперометрия и др. Для одних видов анализа детекция может проводиться непрерывно в ходе реакции, для других – после ее остановки.

Способ остановки ферментативной реакции должен быть указан в фармакопейной статье.

Единицы измерения ферментативной активности

Активность фермента измеряется количеством субстрата, преобразованного в продукт в единицу времени, и выражается в Международных единицах (МЕ) или единицах действия (ЕД).

МЕ – это такое количество фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата за 1 мин (или одного микроэквивалента затронутых реакцией групп в тех случаях, когда атакуется более одной группы в каждой молекуле субстрата).

ЕД – это условная единица активности фермента, величина которой указывается в фармакопейной статье.

Нормируются:

• удельная активность препарата, которая выражается в единицах энзимной активности фермента (МЕ или ЕД) на 1 мг препарата или на 1 мг ферментного белка (в последнем случае удельная активность характеризует чистоту препарата). Определение содержания белка в препарате проводят одним из методов, приведенных в ОФС «Определение белка».
• доза, которая выражается в единицах ферментативной активности (МЕ или ЕД) на единицу лекарственной формы.

Перевод единиц активности ЕД в МЕ и обратно осуществляется опытным путем на основании статистически достаточного материала, обработанного в соответствии с ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Определение активности ферментных препаратов в сравнении со стандартным образцом (СО)

С целью снижения погрешности методов определения ферментативной активности необходимо проводить определение ферментативной активности препарата в сравнении со стандартным образцом (СО) данного фермента.

Определение ферментативной активности испытуемого препарата и СО проводят в одинаковых условиях опыта.

Активность препарата (А) в соответствующих единицах (МЕ или ЕД) вычисляют по формуле:

где:      –     ферментативная активность СО в единицах (МЕ или ЕД) на 1мг белка или препарата;

А0–     величина измеряемого параметра для СО;

П0–     величина измеряемого параметра для испытуемого препарата;

К     –     коэффициент, выравнивающий концентрации растворов испытуемого препарата и СО.

Определение активности иммобилизованных ферментов

Иммобилизованными называются ферменты, молекулы которых физически или химически связаны с каким-либо носителем. В качестве носителей могут быть использованы природные и синтетические полимеры, органические низкомолекулярные носители, неорганические материалы. В зависимости от природы носителя иммобилизованные ферменты могут существовать в форме гелей, пленок, гранул, макропористых порошков и в других формах.

Активность иммобилизованных ферментов может нормироваться на массу носителя или его площадь.

Кинетические характеристики иммобилизованных ферментов, численно определяемые константой Михаэлиса Км и каталитической константой kкат, могут существенно изменяться в зависимости от природы носителя и способа иммобилизации. Поэтому для корректного определения активности иммобилизованных ферментов необходим повторный подбор условий.

Скачать в PDF ОФС.1.2.4.0013.15 Определение активности ферментных препаратов

Методы определения активности ферментов

Ферменты – специфические белки, обладающие каталитической активностью, состоящие из одной или нескольких одинаковых или различных субъединиц. Они имеют высокую молекулярную массу и проявляют каталитическое действие в глобулярной форме.

В состав многих ферментов кроме белковой части, входят и небелковые компоненты, которые называются кофакторами ферментов. Это могут быть ионы некоторых металлов и неметаллов. Многие ферменты в своем составе содержат небольшие по размерам органические соединения, производные витаминов (NAD+, NADP+, ФАД, ФМН, пиридоксальфосфат и др.). Их обычно называют коферментами.

Кофакторы ферментов участвуют в стабилизации третичной и четвертичной структуры ферментов, обеспечивают связь с субстратами, принимают непосредственное участие в каталитическом процессе, например, в переносе электронов, различных химических групп, СО2 и т. п.

Ферменты являются высокоэффективными катализаторами, способными увеличивать скорость химических реакций в миллионы и миллиарды раз. Кроме того ферменты обладают высокой специфичностью как в отношении химической реакции, которую они катализируют, так в отношении субстратов.

Некоторые ферменты существуют в виде нескольких изоформ (изоферментов). Изоферменты – это ферменты которые катализируют одну и туже химическую реакцию, но отличаются друг от друга аминокислотным составом, молекулярной массой, сродством к субстратам, электрофоретической подвижностью, иммунологическими и биохимическими характеристиками (могут иметь различный рН-оптимум, по-разному регулироваться). Различные органы и ткани обычно имеют различный набор изоферментов).

Некоторые ферменты из одного источника, катализирующие одну и ту же реакцию, идентичные по своему аминокислотному составу, могут иметь различную конформацию. В таких случаях говорят о множественных формах фермента. Например, глутаматдегидрогеназа имеет множественные формы, к ним относятся и комплексные формы ферментов (ассоциации щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтрансферазы с липопротеином Х (ЛП-Х).

Фермент, катализируя химическую реакцию, обеспечивает течение реакции с определенной скоростью (V). V– это скорость, с которой уменьшается конценттрация субстрата или увеличивается концентрация продукта в процессе реакции. Иначе говоря, это изменение концентрации субстрата или продукта в единицу времени. Скорость реакции обычно измеряют в мкмоль/ мин и обозначают как МЕ (международная единица).

На скорость ферментативной реакции влияют многие факторы. К основным можно отнести: концентрации субстрата и фермента, присутствие активатора или ингибитора и их концентрации, рН и температуры среды, природу буферного раствора и его концентрацию.

Одним из наиболее важных факторов, определяющих скорость ферментативной реакции, является концентрация субстрата [S]. При низких концентрациях субстрата (≤ 10% от насыщающей) скорость реакции V прямо пропорциональна концентрации субстрата.

При высоких концентрациях субстрата (насыщающая концентрация), скорость реакции достигает своего максимума Vmax и не зависит от концентрации субстрата. Именно поэтому активность фермента определяют при насыщающей концентрации субстрата, которая численно равна скорости ферментативной реакции в оптимальных условиях на начальном линейном участке кинетической кривой. Концентрация субстрата при этом должна в 5-10 раз превышать константу Михаэлиса-Ментен (Км).

Каталитическую активность ферментов выражают в единицах активности. Чаще всего в лабораторной практике используют международные единицы активности.

Международная единица активности (МЕ, U, Е, Ед)– это количество фермента, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата или получение 1 мкмоля продукта в минуту в стандартных условиях (мкМоль/ мин).

Единица активности в системе СИ – катал (кат). Она соответствует количеству фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата или получение 1 моля продукта в секунду (моль/сек)

1 кат = 6 • 106 МЕ; 1 МЕ = 16,67 • 10 -9 кат.

В медицине концентрацию ферментов в биологических жидкостях принято выражать в единицах активности на литр (МЕ/л, кат/л).

Иногда используют другие (не международные) единицы активности, особенно в тех случаях, когда субстрат или продукт реакции невозможно выразить в мкмоль/л. Такая ситуация складывается при использовании в качестве субстрата полимерных соединений с неизвестной молекулярной массой. Так, при определении активности α-амилазы методом Каравея в качестве субстрата используют растворимый крахмал, который представляет собой смесь полисахаридов различной молекулярной массы. Поэтому активность фермента выражают в граммах или мг крахмала, гидролизованного одним литром сыворотки крови (мочи) за 1 час , т. е. г/(л•час) или мг/(л•час).

В большинстве случаев скорость ферментативной реакции прямо пропорцициональна концентрации фермента,т. е. определив по скорости реакции активность фермента, можно оценить концентрацию фермента в биологической жидкости.

Кроме того, скорость ферментативной реакции, а значит и активность фермента, зависит от природы субстрата и с различными субстратами для одного и того же фермента она может отличаться в несколько раз.

Скорость ферментативной реакции зависит от рН реакционной смеси. Объясняется это тем, что в активные центры ферментов входят различные ионогенные группы белковых молекул, которые при различных значениях рН среды ионизируются по-разному. Значение рН, при котором достигается максимальная скорость катализируемой реакции, называют рН-оптимум фермента. Например, рН-оптимум пепсина равен 1,5. а щелочной фосфатазы -9-10. Исходя из этого определение активности того или иного фермента в биологической жидкости необходимо проводить при рН, близкого к рН-оптимуму данного фермента.

Скорость ферментативной реакции зависит от температуры реакционной смеси. Повышение температуры всего лишь на один градус Цельсия увеличивает скорость ферментативной реакции на 2,5- 20,0%. При более высоких температурах происходит денатурация ферментов и они теряют каталитические свойства. Поэтому активность ферментов определяют при фиксированной температуре (25, 30, 37оС).

Существенное влияние на скорость ферментативной реакции оказывает ионная сила раствора, в котором измеряется активность ферментов. Так как измерение активности ферментов в биологическом материале производят в буферных растворах, их концентрация может колебаться от 0,01 до 0,10 моль/л, что может отражаться на величине измеренной активности ферментов. Более того, состав буферных смесей также оказывает влияние на активность одного и того же фермента.

Из сказанного следует, что скорость катализируемой ферментом реакции, а значит и его активность, существенно зависит от условий инкубационной среды. Поэтому для получения правильных и воспроизводимых результатов от персонала лабораторий требуется, наряду с точным выполнением прилагаемой инструкции, также понимание сути происходящих во время анализа процессов.

Классификация ферментов

В организме человека, животных, растений, микроорганизмов содержится большое количество ферментов, катализирующих различные по химической сущности реакций. Комиссией по ферментам Международного биохимического союза разработаны классификация и номенклатура ферментов. В основе принятой классификации ферментов лежит специфичность их действия. По типу катализируемых реакций все ферменты делятся на 6 основных классов (табл.1).

Таблица 1. Классы ферментов

Каждый класс ферментов разделяется на подклассы, которые в свою очередь деляться на подподклассы по тому же принципу, т. е. по типу катализируемой реакции. Каждому ферменту в Международной классификации ферментов присваивается четырехзначный код. Первое число кода указывает на принадлежность фермента к одному из шести классов, второе – к подклассу, третье – к подподклассу, и наконец, четвертое число-это порядковый номер фермента в подподклассе. Например, уреаза (систематическое название мочевина: амидогидролаза) имеет шифр 3.5.1.5.

Механизмы изменений активности ферментов в биологических жидкостях

Большая часть ферментов локализована внутри клеток. Одни из них находятся в цитозоле (например, ферменты гликолиза), другие в клеточных мембранах (митохондрий, лизосом, эндоплазматической сети и т. п.). В кровоток ферменты поступают из клеток при их повреждении, некрозе, при повышении проницаемости цитоплазматических мембран. Количество поступающих из поврежденных клеток в кровоток ферментов зависит от количества поврежденных клеток, от содержания ферментов в клетках и прочности связи ферментов с биологическими мембранами. Во внеклеточной среде, в том числе и в крови, ферменты клеток обычно находятся непродолжительное время. У разных ферментов крови время удаления из кровотока различное, от нескольких минут, до нескольких дней.

В таблице 2 приведены в качестве примера периоды «полужизни» некоторых ферментов в плазме крови.

Таблица 2. Периоды «полужизни» некоторых ферментов в плазме крови

Каким превращениям подвергаются находящиеся в крови ферменты? Внеклеточная среда для клеточных ферментов является чужеродной средой, с иным электролитным, биохимическим составом, с отличными от клеток физико-химическими параметрами, поэтому под действием различных факторов внеклеточной жидкости белковые молекулы ферментов в крови подвергаются различным конформационным и химическим превращениям. В частности, поскольку любое повреждение клеток (тканей) вызывает воспалительную реакцию организма, молекулы ферментов крови подвергаются т. н. физиологической денатурации, при которой они становятся эндогенными патогенами (флогогенами, от греч. флогос – воспаление), Флогогены фагоцитируются моноцитами и макрофагами исчезая, из кровотока. Лишь низкомолекулярные ферменты, такие как альфа-амилаза поджелудочной железы, способны проникать через почечный фильтр и выводится из организма с мочой. Все остальные ферменты, имеющие достаточно большие молекулярные массы, не способны удалятся из кровотока путем экскреции почками. Удаление (элиминация) таких патогенов (повторим, что во внеклеточной среде клеточные ферменты являются чужеродными веществами, флогогенами) происходит главным образом в процессе воспалительной реакции путем фагоцитоза моноцитами, нейтрофилами и макрофагами. Все эти процессы очищения крови от чужеродных веществ (физиологически денатурированных эндогенных патогенов) осуществляется в основном путем фагоцитоза.