На каком свойстве белков основан метод электрофореза

На каком свойстве белков основан метод электрофореза thumbnail

Электрофоре́з белко́в — способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки, основанный на движении заряженных белковых макромолекул различного молекулярного веса в стационарном электрическом поле. Электрофорез белков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков является электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли[en][2][3].

Варианты метода электрофореза белков[править | править код]

Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются (или использовались в определённые периоды развития биохимии и молекулярной биологии) в различных областях[3]:

  • Электрофорез в свободных средах (без поддерживающей среды)
    • Электрофорез с подвижной границей
    • Зональный электрофорез без поддерживающей среды
  • Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой
    • Электрофроез белков в крахмальном геле[4]
    • Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)[5]
    • Электрофорез белков в агарозном геле
    • Электрофорез на фильтровальной бумаге
    • Электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране
    • Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды
  • Капиллярный электрофорез

Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный (2D) электрофорез[6], препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков[en] и электрофорез в присутствии детергента (в денатурирующих условиях). Разновидностью метода электрофореза являются изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез. В случае использования иммунологических методов для выявления разделённых белков говорят про иммуноэлектрофорез.

В зависимости от конструкции электрофоретического аппарата различают горизонтальный и вертикальный электрофорез белков.

История и области применения[править | править код]

После первых экспериментов с электрофорезом, проводившихся в нескольких лабораториях в 1930-е — 1940-е годы, в том числе пионером электрофореза — нобелевским лауреатом Арне Тиселиусом[7], существенный прогресс в дальнейшем развитии и применении этого метода для разделения белков начался в 1955 году с разработки зонального электрофореза в крахмальном геле, которую осуществил Оливер Смитис, впоследствии также нобелевский лауреат[4][8]. Метод совершенствовался[9][10] и получил большое распространение в экспериментальной биохимии и молекулярной биологии.

В 1959 году был предложен метод электрофореза белков в ПААГ[5], в 1962 году — метод диск-электрофореза[11], в 1969 году — применение денатурирующих агентов (SDS)[12]. В 1970 году Лэммли значительно усовершенствовал электрофорез в ПААГ, разделив 28 белковых компонентов бактериофага T4[2]. В 1975 году появился двумерный (2D) электрофорез[6].

Электрофорез белков нашёл широкое применение в биологических исследованиях, как фундаментальных[2][4][13], так и прикладных[14][15][16][17][18]. Ряд вариантов метода используется и поныне; например, 2D-электрофорез является в протеомике одним из методов изучения протеома[19].

См. также[править | править код]

  • Протеом
  • Электрофорез
  • Электрофорез белков в полиакриламидном геле
  • Электрофорез в полиакриламидном геле

Примечания[править | править код]

  1. Schägger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa (англ.) // Analytical Biochemistry : журнал. — Orlando, FL, USA: Academic Press, 1987. — Vol. 166, no. 2. — P. 368—379. — ISSN 0003-2697. — PMID 2449095. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 6 апреля 2018 года.
  2. 1 2 3 Laemmli U. K.. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 (англ.) // Nature : журнал. — London, UK: Nature Publishing Group, 1970. — Vol. 227, no. 5259. — P. 680—685. — ISSN 1476-4687. — doi:10.1038/227680a0. — PMID 5432063. Архивировано 27 февраля 2015 года. (Проверено 27 февраля 2015)
  3. 1 2 Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). — М.: Наука, 1981. — 288 с.
  4. 1 2 3 Smithies O. Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults (англ.) // The Biochemical Journal : журнал. — London, UK: Biochemical Society; Portland Press, 1955. — Vol. 61, no. 4. — P. 629—641. — ISSN 0264-6021. — PMID 13276348. Архивировано 27 февраля 2015 года. (Проверено 27 февраля 2015)
  5. 1 2 Raymond S., Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis (англ.) // Science : журнал. — Washington, D.C., USA: American Association for the Advancement of Science, 1959. — Vol. 130, no. 3377. — P. 711. — ISSN 0036-8075. — PMID 14436634. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 6 октября 2017 года.
  6. 1 2 O’Farrell P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins (англ.) // The Journal of Biological Chemistry : журнал. — Baltimore, MD, USA: American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 1975. — Vol. 250, no. 10. — P. 4007—4021. — ISSN 4406-4412. — PMID 236308. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 18 января 2020 года.
  7. Tiselius A. A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures (англ.) // Transactions of the Faraday Society : журнал. — London, UK: Faraday Society, 1937. — Vol. 33. — P. 524—531. — ISSN 0014-7672. — doi:10.1039/TF9373300524. (Проверено 28 февраля 2015) Архивировано 10 августа 2020 года.
  8. ↑ Electrophoresis: Theory, Methods and Applications / Ed. by M. Bier. — 3rd printing edn. — New York, NY, USA: Academic Press, 1964. — P. 225. — 563 p. (англ.) (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 5 октября 2017 года.
  9. Smithies O. An improved procedure for starch-gel electrophoresis: further variations in the serum proteins of normal individuals (англ.) // The Biochemical Journal : журнал. — London, UK: Biochemical Society; Portland Press, 1959. — Vol. 71, no. 3. — P. 585—587. — ISSN 0264-6021. — PMID 13638269. Архивировано 27 февраля 2015 года. (Проверено 27 февраля 2015)
  10. Gahne B. Studies on the inheritance of electrophoretic forms of transferrins, albumins, prealbumins and plasma esterases of horses (англ.) // Genetics : журнал. — Baltimore, MD, USA: Genetics Society of America, 1966. — Vol. 53, no. 4. — P. 681—694. — ISSN 0016-6731. — PMID 5960258. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 5 октября 2017 года.
  11. Ornstein L., Davis B. J. Disc Electrophoresis. — Rochester, NY, USA: Distillation Products Industries, Eastman Kodak Co., 1962. (англ.)
  12. Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (англ.) // The Journal of Biological Chemistry : журнал. — Baltimore, MD, USA: American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 1969. — Vol. 244, no. 16. — P. 4406—4412. — ISSN 0021-9258. — PMID 5806584. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 18 января 2020 года.
  13. Hunter R. L., Merkert C. L. Histochemical demonstration of enzymes separated by zone electrophoresis in starch gels // Science. — 1957. — Vol. 125. — P. 1294—1295. (англ.)
  14. Baker C. M. A. Molecular genetics of avian proteins. IX. Interspecific and intraspecific variation of egg white proteins of the genus Gallus (англ.) // Genetics : журнал. — Baltimore, MD, USA: Genetics Society of America, 1968. — Vol. 58, no. 2. — P. 211—226. — ISSN 0016-6731. — PMID 5960258. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 6 октября 2017 года.
  15. Baker C. M. A., Croizier G., Stratil A., Manwell C. Identity and nomenclature of some protein polymorphisms of chicken eggs and sera (англ.) // Advances in Genetics : журнал. — New York, NY, USA: Academic Press, 1970. — Vol. 15. — P. 147—174. — ISSN 0065-2660. — PMID 4936422. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 13 октября 2020 года.
  16. Romanov M. N. (1988-06-07). “Study of genetic polymorphism of ovoproteins in some egg type and meat-egg type lines of chickens” in 4th Symposium of Young Poultry Scientists. Abstracts: 10, Kraków, Poland: World’s Poultry Science Association, Polish Branch. OCLC 899128291. Проверено 2015-02-28.  (англ.) Архивировано 6 октября 2017 года.
  17. Романов М. Н. (1994-01-27). “Электрофоретическое изучение овопротеиновых локусов в популяциях яичных кур в процессе совершенствования кросса «Хайсекс коричневый»” in I Междунар. конф. по молекулярно-генетическим маркерам животных, Киев, 27—29 января 1994. Тез. докл.: 34—35, Киев, Украина: Укр. акад. аграр. наук, Ин-т разведения и генетики животных, Ин-т агроэкологии и биотехнологии; Аграрна наука. ЦНСХБ, TRN: RU9815007X. OCLC 899128337. Проверено 2015-02-28.  Архивировано 6 октября 2017 года.
  18. Романов М. Н.; Черников В. Ф. (1994-01-27). “Полиморфные овобелки как маркеры внутрипопуляционной изменчивости озёрной чайки” in I Междунар. конф. по молекулярно-генетическим маркерам животных, Киев, 27—29 января 1994. Тез. докл.: 35—36, Киев, Украина: Укр. акад. аграр. наук, Ин-т разведения и генетики животных, Ин-т агроэкологии и биотехнологии; Аграрна наука. OCLC 899128260. Проверено 2015-02-28.  Архивировано 8 августа 2020 года.
  19. Komatsu S., Kojima K., Suzuki K., Ozaki K., Higo K. Rice Proteome Database based on two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis: its status in 2003 (англ.) // Nucleic Acids Research : журнал. — Oxford, UK: Oxford University Press, 2004. — Vol. 32, no. Database issue. — P. D388—D392. — ISSN 0305-1048. — PMID 14681440. (Проверено 28 февраля 2015) Архивировано 3 июня 2018 года.

Литература[править | править код]

  • Vesterberg O. History of electrophoretic methods // Journal of Chromatography. — 1989. — Vol. 480. — P. 3—19. (англ.)

Ссылки[править | править код]

  • Allozyme Electrophoresis Techniques (англ.) (недоступная ссылка). Fishing: Research: Gene Conservation Lab. Division of Commercial Fisheries, Alaska Department of Fish and Game, State of Alaska. — Пособие по электрофорезу в крахмальном геле. Дата обращения 27 февраля 2015. Архивировано 27 февраля 2015 года.

Источник

Фотография полиакриламидного геля, иллюстрирующая разделение белков по молекулярной массе. Маркеры на левой дорожке

Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов). Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.

Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (англ. SDS PAGE).

Механизм разделения[править | править код]

Электрофоретическая подвижность биополимеров в геле зависит от ряда параметров. Скорость миграции пропорциональна заряду молекулы, и в свободной жидкости молекулы с одинаковым удельным зарядом мигрируют с равной скоростью. В случае разделения в среде, имеющей жесткую пространственную матрицу, происходит сегрегация за счет трения о гель. Сила трения зависит от пространственной конфигурации молекулы, в том числе от её размера. Таким образом, в случае электрофоретического разделения нативных белков будет наблюдаться сложная картина их распределения в зависимости от вышеприведенных факторов.

SDS-PAGE по Лэммли[править | править код]

В 1970 году Лэммли (англ. Laemmli) для изучения процесса сборки капсида бактериофага Т4 предложил метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле в зависимости от молекулярной массы[1]. Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфата, имеющего в растворе отрицательный заряд.

При использовании описываемого метода исходят из следующих допущений:

  • белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
  • количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
  • собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.

В данных условиях, все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы. Практика подтверждает верность данных предположений в подавляющем большинстве случаев.

Для проведения денатурирующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез (от англ. discontinous — разрывный) то есть используют гель, состоящий из двух частей. Концентрирующий гель имеет pH 6,8 и концентрацию полиакриламида от 2 до 8 %. Разделяющий гель имеет рН в районе 8,5-9 и концентрацию полиакриламида от 5 до 20 %. Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6,8 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда (который определяется силой тока в электрофоретической ячейке), отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью. При рН 8,8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся (в переносе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью). Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода.

В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе.

Визуализация продуктов разделения[править | править код]

Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание белков в гелях красителем Кумасси или серебром. Для проведения вестерн-блоттинга белки переносят из геля на нитроцеллюлозную мембрану.

Интерпретация результатов[править | править код]

В большинстве случаев результаты электрофоретического разделения достаточно получить путём визуальной оценки геля. Однако с целью получения достоверных данных и надлежащего документирования результатов гель сканируют на просвет при помощи высокочувствительного денситометра. По сути, денситометр является сканером, который относится к контрольно-измерительным приборам и подлежит поверке с целью определения и подтверждения соответствия характеристик средства измерения установленным требованиям. Подобные требования к денситометру позволяют надежно определять не только положение белков в геле, но и оптическую плотность белкового пятна. Оцифрованное изображение геля обрабатывают при помощи специализированного программного обеспечения, которое позволяет достоверно определить такие параметры как электрофоретическая подвижность белка, его чистота, количество белка в пятне и др.

Определение молекулярной массы белков[править | править код]

Определение молекулярной массы исследуемого белка предполагает необходимость калибровки геля по молекулярным массам. Калибруют гель относительно молекулярных масс белков-маркеров, которые разделяют параллельно с исследуемым образцом. Смеси маркерных белков доступны в различном интервале масс. Калибрование предполагает построения зависимости относительной электрофоретической подвижности (Rf) каждого из маркерных белков от десятичного логарифма их молекулярной массы. Обычно зависимость имеет вид сигмообразной кривой. Расчет молекулярной массы исследуемого белка осуществляют относительно его Rf, используя при этом метод регрессионного анализа. Достоверными результаты считаются в случае, если длина пробега белков-маркеров составляет не менее 80 % длины разделяющего геля, а зависимость их Rf от логарифма молекулярной массы является линейной (R2> 0,95). То есть для расчетов используют лишь тот участок калибровочной кривой, который покрывает электрофоретическую подвижность исследуемого белка.

Чувствительность метода SDS-PAGE по Лэммли обратно пропорциональна молекулярной массе белка. Например, в интервале 10-20 кДа удается разделить белки, отличающиеся всего на 0,1 кДа (разница всего в один аминокислотный остаток). Однако для получения удовлетворительных результатов следует выполнить несколько простых методических рекомендаций. Так, в связи с тем, что высокая электропроводность исследуемых образцов способна значительно исказить электрофоретическую подвижность белка, их ионная сила должна быть по возможности минимальной и приблизительно равной. Еще одним важным условием надежности определения молекулярной массы является оптимальная нагрузка белка на гель. При окраске Coomassie Blue R250 оптимальное содержание белка в пятне должно находиться в пределах 0,1-1 мкг и как минимум на порядок меньше при окраске серебром. В противном случае белки в геле сформируют широкие пятна, что затруднит определение их электрофоретической подвижности. Несмотря на высокую чувствительность и несложность метода молекулярная масса белков, определенная с использованием SDS-PAGE, часто отличается от истинного значения. Разница может составлять от нескольких кДа для низкомолекулярных белков до десятков кДа для высокомолекулярных белков.

Количественное определение белков[править | править код]

Метод SDS-PAGE незаменим в случае необходимости количественного определения индивидуального белка в сложном не только по белковому составу образце. Примером такого образца могут быть грубые экстракты или лизаты клеток. При этом метод пригоден для исследования как нативных белков, так и белков, изменивших свою структуру. Такими белками могут быть полимеры, агрегаты или полностью денатурированные молекулы. Относительная нетребовательность метода к составу образца и структурному состоянию в нем белков выгодно отличают SDS-PAGE от других методов количественного определения, например, высокоэффективной жидкостной хроматографии или иммуноферментного анализа.

Количественное определение белка с помощью SDS-PAGE предполагает необходимость калибровки геля относительно зависимости интенсивности окраски белкового пятна в геле от количества белка в этом пятне. Для этого в геле параллельно с исследуемыми образцами разделяют несколько образцов сравнения с точно известным разным количеством эталонного белка. После визуализации белков в геле с помощью денситометра проводят измерение плотности каждого белкового пятна образцов сравнения. Определяют зависимость этой плотности от количества белка. Калиброванный гель используют для расчета количества исследуемого белка относительно плотности его пятна, используя при этом метод регрессионного анализа. Достоверными результаты считаются в случае, если зависимость плотности белковых пятен для эталонного белка от количества белка в пятне является линейной (R2> 0,95). То есть для расчетов используют лишь тот участок калибровочной кривой, который покрывает плотность пятна исследуемого белка. При этом следует отметить, что подбор оптимальной концентрации белка в исследуемом образце осуществляют эмпирически.

При количественном определении белков с помощью SDS-PAGE следует учитывать одну существенную особенность этого метода. Так, в связи с тем, что эффективность окраски белка в геле зависит от его природы, например, аминокислотного состава, молекулярной массы, наличия простетических групп, эталонный белок, используемый для калибровки геле, и исследуемый белок должны быть идентичными. В случае отступления от этого правила разница между истинным и полученным количеством может отличаться в несколько раз.

Определение белковых примесей[править | править код]

Метод SDS-PAGE по Лэммли позволяет количественно определить содержание только тех примесей, которые отличаются своей молекулярной массой от молекулярной массы исследуемого белка. Для этого в одном геле разделяют исследуемый образец параллельно с одним или несколькими образцами сравнения, количество эталонного белка в которых сравнимо с ожидаемым количеством примесей в растворе исследуемого белка. Например, если концентрация белка в исследуемом образце составляет 1 мг/мл, а ожидаемое количество примесей в нем находиться в пределах 1 %, то в качестве образца сравнения используют минимум один раствор эталонного белка с концентрацией 10 мкг/мл. После визуализации белков в геле с помощью денситометра проводят измерение плотности каждого белкового пятна для исследуемого образца и образца сравнения.

Метод SDS-PAGE пригоден для определения димеров и полимеров белка, накапливающихся за счет спонтанного замыкания межмолекулярных дисульфидных связей, например, во время ненадлежащего хранения препарата. Для этого исследуемый белок и белок сравнения разделяют в геле в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Примеси являются димерами и полимерами в том случае, если они выявляются в восстанавливающих и не выявляются в невосстанавливающих условиях. При этом их молекулярная масса должна быть кратна молекулярной массе испытуемого белка. Таким образом, оценка чистоты белкового препарата методом SDS-PAGE в восстанавливающих условиях позволяет определить только негомологичные белковые примеси.

Результаты определения чистоты образца могут быть как полуколичественными, так и количественными. В том случае, если сравнение плотности пятен примесных белков проводят относительно одного пятна эталонного белка, полученный результат является полуколичественным. Его формулировка может звучать, например, следующим образом: «Содержание белковых примесей в исследуемом растворе не превышает 1 %». Количественное определение белковых примесей проводят согласно рекомендациям к количественному определения белков методом SDS-PAGE.

В дополнение к описанным подходам в некоторых лабораториях практикуется способ определения гомогенности препарата без использования образцов сравнения. В таком случае чистота исследуемого белка определяется по плотности пятна в геле, которое оценивается в процентах от суммы плотностей всех выявленных белковых пятен. Такой подход не отражает истинное количество примесей, однако может служить качественной оценкой чистоты препарата. Метод нельзя отнести к количественным в связи с тем, что число и плотность выявленных белковых пятен прямо пропорционально количеству общего белка в испытуемом образце и чувствительности метода определения белков в геле. К том же, зависимость плотности белкового пятна от количества в нем белка в диапазоне, превышающем один порядок, часто не линейна.

Буферные системы[править | править код]

Для электрофореза белков в полиакриламидном геле в качестве буферных растворов используют: Трис-HCl, Трис-трицин, TBE, TBE с мочевиной, Bis-Tris.

См. также[править | править код]

  • Электрофорез белков
  • Электрофорез ДНК
  • Изотахофорез
  • Капиллярный электрофорез

Примечания[править | править код]

Литература[править | править код]

  • Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.
  • Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М., МЦНМО, 2002, 248 с.
  • Д. Кларк, Л. Рассел Молекулярная биология: простой и занимательный подход. Глава 16 (Методы молекулярной биологии).
  • Анимация электрофореза белков в полиакриламидном геле в присутствии SDS (недоступная ссылка)

Источник