На каких свойствах белков основан метод аффинной хроматографии
Изучение физико-химических свойств, химического состава и структуры возможно только при исследовании очищенного белкового препарата. Для выделения и фракционирования индивидуальных белков используются: высаливание, осаждение органическими растворителями, гельфильтрация, электрофорез, ионообменная хроматография, аффинная хроматография.
Высаливание белковосновано на зависимости растворимости белка от свойств среды. В дистиллированной воде протеины растворяются хуже, чем в слабых растворах солей, так как низкие концентрации ионов поддерживают их гидратные оболочки. Но при высоких концентрациях соли молекулы белка теряют гидратные оболочки, агрегируют и образуется осадок. После удаления соли белки вновь переходят в раствор, сохраняя нативные свойства и конформацию.
Изменение растворимости при различных концентрациях соли и рН среды используется для выделения индивидуальных белков. Чаще всего для высаливания белков используют растворы сульфата аммония разной концентрации.
Осаждение белков из раствора без их денатурации осуществляют с помощью дегидрирующих агентов – органических растворителей (этанол, ацетон).
Гель-фильтрацияоснована на разделении белков по величине и форме молекулы. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных гранулами пористого геля (сефадекса, агарозы), в буферном растворе с определенным значением рН. Гранулы геля проницаемы для белков благодаря внутренним каналам (порам) с определенным средним диаметром, размер которого зависит от типа геля (сефадекс G-25, G-200 и т.д.). Смесь белков вносят в колонку и затем вымывают (элюируют) буферным раствором с определенным значением рН. Крупные молекулы белка не проникают в поры геля и перемещаются с высокой скоростью вместе с растворителем. Мелкие молекулы низкомолекулярной примеси (соли) или другого белка удерживаются гранулами геля и вымываются из колонки медленнее (рис. 1.29). На выходе колонки раствор (элюат) собирают в виде отдельных фракций.
Рис. 1.29. Разделение белков методом гель-фильтрации
Электрофорезоснован на свойстве заряженных молекул белка перемещаться в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие при данном значении рН суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду, а положительный – к катоду. Электрофорез проводят на разных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. Скорость перемещения зависит от заряда, массы и формы молекул белка. После завершения электрофореза зоны белков на носителе окрашивают специальными красителями (рис. 1.30, А).
Разрешающая способность электрофореза в геле выше, чем на бумаге, так при электрофорезе белков сыворотки крови на бумаге выделяют 5 фракций (альбумины, α1-, α2-, β-, γ-глобулины), а в полиакриламидном геле – до 18 фракций (рис. 1.30, Б).
Рис. 1.30. Электрофореграмма белков сыворотки крови здорового человека
А– электрофореграмма белков сыворотки крови на бумаге;
Б– количество белков плазмы разных фракций.
I – γ-глобулины; II – β-глобулины; III – а2-глобулины;
IV – а1-глобулины; V – альбумины
Ионообменная хроматографияоснована на разделении белков, отличающихся суммарным зарядом. Раствор белка с определенным значением рН пропускают через хроматографическую колонку, заполненную твердым пористым сорбентом, при этом часть белков задерживается в результате электростатического взаимодействия. В качестве сорбента используют ионообменные вещества: анионообменники (содержащие катионные группы) для выделения кислых белков; катионообменники (содержащие анионные группы) для выделения основных белков.
При пропускании белка через колонку прочность его связывания с ионообменником зависит от величины заряда, противоположного заряду сорбента. Адсорбированные на ионообменном сорбенте белки элюируют буферными растворами с различной концентрацией соли и рН, получая разные фракции белков.
Аффинная хроматографияоснована на специфичности связывания белка с лигандом, присоединенным к твердому носителю. В качестве лиганда используются субстраты ферментов, простетические группы холопротеинов, антигены и т.д. При пропускании через колонку смеси белков к лиганду присоединяется только комплементарный протеин (рис. 1.31, А), все остальные выходят вместе с раствором. Адсорбированный белок элюируется раствором с другим значением рН (рис. 1.31, Б). Этот метод высокоспецифичен и позволяет получать белковые препараты высокой степени очистки.
Выделение и очистка белка обычно проходят в несколько стадий с использованием различных методов. Последовательность стадий подбирается эмпирическим путем и может различаться для разных протеинов. Высокая степень очистки белков очень важна как при использовании их в качестве лекарственных препаратов (гормон инсулин и т.д.), так и при диагностике различных заболеваний по изменению белкового состава тканей, крови, слюны и др.
Набор белков в клетках различных органов взрослого человека индивидуален и поддерживается относительно постоянным на протяжении жизни. Специализированные ткани могут содержать специфические белки, например гемоглобин в эритроцитах, актин и миозин в мышцах, родопсин в сетчатке глаза, разные типы коллагена в костной и соединительной тканях. Некоторые белки содержатся во многих тканях, но в разных количествах. Отдельные изменения состава
Рис. 1.31. Разделение белков методом аффинной хроматографии
А– связывание выделяемого белка со специфическим лигандом, присоединенным к нейтральному носителю; Б– получение раствора индивидуального белка
белков тканей и крови возможны и связаны прежде всего с режимом питания, составом пищи, физической активностью человека.
При заболеваниях белковый состав крови и клеток тканей может существенно изменяться, часто развивается недостаточность какого-либо белка либо снижение его активности – протеинопатия.Поэтому определение выраженных изменений белкового состава крови и тканей используется для диагностики различных заболеваний в клинических исследованиях.
Источник
Аффинная хроматография — это разновидность адсорбционной хроматографии. Основной особенностью аффинной хроматографии является наличие комплементарности между иммобилизованным на матрице лигандом и вторым партнером пары взаимодействующих компонентов, который извлекается из смеси с другими, не комплементарными лиганду веществами. Использование высокоизбирательного взаимодействия позволяет за одну стадию достичь очень высокой степени очистки искомого вещества. Аффинное взаимодействие является нековалентным и может быть ослаблено путем изменения рН, ионной силы раствора, введения в раствор веществ, препятствующих образованию комплементарных связей. Важными преимуществами аффинной хроматографии являются: высокая избирательность, эффект концентрирования искомого вещества на аффинной матрице и освобождение от гидролитических ферментов. Аффинная очистка часто позволяет сохранить нативную структуру вещества.Чаще всего лиганд иммобилизуют на матрице ковалентно. Для закрепления лиганда матрица должна быть предварительно активирована, то есть на поверхности частиц носителя должны быть созданы реакционноспособные группы. Наиболее распространенный способ активации — создание на поверхности матрицы электрофильных групп, способных к взаимодействию с нуклеофильными группами лиганда. При этом процесс иммобилизации лиганда сводится к его инкубации с активированной матрицей. Следует отметить, что скорость протекания реакции сильно зависит от pH среды. В иммунохимии применяют как иммобилизацию антигена на матрице, так и присоединение к матрице антител. Разновидность аффинной хроматографии, в которой в качестве иммобилизованного лиганда используются антитела, носит название иммуноаффинной хроматографии.
Одним из наиболее распространенных носителей, используемых в биохимии уже на протяжении нескольких десятилетий, является сефароза — специальным образом обработанные сферические гранулы агарозы. Известно несколько способов активации сефарозы, однако чаще других применяют метод активации сефарозы с использованием бромциана (BrCN). Преимуществом данного метода является простота, высокая устойчивость образующихся связей, стабильность сефарозы в довольно широком диапазоне рН (от 2,0 до 12,0). Относительная жесткость и крупные размеры частиц сефарозы позволяют использовать такие носители в колоночной хроматографии при достаточно высоких скоростях подачи растворов на колонку.
Активацию сефарозы осуществляют в процессе инкубации раствора бромциана с водной суспензией сефарозы. Бромциан взаимодействует с гидроксильными группами сефарозы, в результате чего образуется имидокарбонат, содержащий электрофильный атом углерода. Помимо этого в ходе реакции образуется неактивный карбамат, не способный к реакции с нуклеофильными боковыми группами аминокислот. При взаимодействии имидокарбоната с нуклеофильными группами, прежде всего с e-аминогруппами лизина, происходит образование прочной ковалентной связи белка с активированной матрицей через остаток изомочевины или N-замещенного карбамата (рис. 1). Реакция активации матрицы бромцианом проходит только в щелочной среде с выделением бромистоводородной кислоты, для нейтрализации которой требуется постоянное добавление щелочи к реакционной смеси. Реакция бромциана с гидроксилами матрицы экзотермична, поэтому ее проводят на ледяной бане.
Рис. 1. Схема иммобилизации белка на BrCN-активированной сефарозе
Нужно заметить, что активными нуклеофилами, кроме e-аминогрупп лизина, являются также SH-группа цистеина, концевые аминогруппы белков и ОН-группа тирозина (по активности данные группы располагаются в следующем порядке: SH- ˃ концевая NH2- ˃ OH-группа тирозина). С другой стороны, тиоэфиры менее прочны, чем кислородные эфиры, а последние уступают по прочности амидным связям.
В иммунохимических исследованиях с использованием BrCN-активированной сефарозы готовят два типа носителей — носители с иммобилизованными антигенами и носители с иммобилизованными антителами. Первые имеют ограниченное применение и используются, как правило, для выделения из сыворотки иммунного животного (содержащей антитела различной специфичности) пула антител, специфичных только к белку, иммобилизованному на носителе. Гораздо чаще на практике используют носители с иммобилизованными антителами. Основная область применения таких носителей — экстракция из грубой смеси макромолекул (как правило — белков). Высокая специфичность антител к антигену позволяет за короткий промежуток времени и в одну стадию получить высокоочищенный (с чистотой до 95-99%) препарат белка.
Рис. 2. Установка для колоночной иммуноаффинной хроматографии
Экстракцию исследуемого белка из смеси осуществляют двумя способами. Первый, используемый, как правило, для получения препаративных количеств белка, основан на применении метода колоночной иммуноаффинной хроматографии (Рис.2). В зависимости от поставленной задачи аффинным носителем заполняют колонки различного диаметра (от нескольких миллиметров до метра) и через эти колонки пропускают белковый раствор, содержащий исследуемый антиген. Большинство макромолекул проходит через частицы носителя не задерживаясь, в то время как между антителами, иммобилизованными на носителе, и антигеном, содержащимся в растворе, образуется иммунный комплекс (рис. 3). После отмывки носителя от не связавшихся белков иммунный комплекс разрушают, пропуская через носитель растворы с низкими (pH 2,0 — pH 4,0) или высокими (pH 11,0 — pH 12,0) значениями рН, либо растворы с высокой ионной силой (2М NaCl), либо растворы, содержащие хаотропные соединения (KSCN). При этом исследуемый белок элюируют с носителя, его собирают и переводят в оптимальный для хранения данного белка буфер.
Рис. 3. Схема хроматографии белков на аффинном носителе.
Второй способ экстракции исследуемого белка из сложной смеси — иммунопреципитация, или экстракция в объеме. Иммунопреципитацию используют при работе с незначительными (нано- и микрограммы) количествами вещества. При этом объем аффинного носителя обычно не превышает сотен микролитров, а объем исследуемого образца — нескольких миллилитров. То есть, иммунопреципитацию используют в тех ситуациях, когда из-за малого количества исследуемого вещества оказывается технически сложным создать адекватную по размерам аффинную колонку.
Рис. 4. Схема аффинного выделения белков методом иммунопреципитации.
При проведении иммунопреципитации образец, содержащий исследуемый белок, некоторое время инкубируют (при постоянном перемешивании) с частицами носителя. В процессе инкубации образуется иммунный комплекс, и исследуемый белок переходит из раствора на частицы носителя. После этого носитель осаждают, как правило, центрифугированием, супернатант отбрасывают, а иммунный комплекс, иммобилизованный на частицах носителя, разрушают добавлением тех же растворов, что и в случае с колоночной хроматографией (рис. 4). Также иммунный комплекс может быть разрушен ДСН-содержащим буфером, который используют для приготовления образца белка при проведении ДСН электрофореза. Такой буфер используют в том случае, если в дальнейшем планируют изучать экстрагированный белок с использованием метода электрофореза в денатурирующих условиях, или методом вестерн-блоттинг. Однако при использовании данного метода элюции белка следует учитывать, что повторное использование носителя становится невозможным из-за денатурации иммобилизованных антител. Кроме того, исследуемый образец помимо целевого белка будет содержать легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов.
Версия для печати
Источник
Аффинная хроматография – это метод отделения биомолекулы от смеси, основанный на высокоспецифическом макромолекулярном связывающем взаимодействии между биомолекулой и другим веществом. Конкретный тип связывающего взаимодействия зависит от интересующей биомолекулы; Взаимодействия связывания антигена и антитела , фермента и субстрата , рецептора и лиганда или белка и нуклеиновой кислоты часто используются для выделения различных биомолекул. Аффинная хроматография полезна благодаря своей высокой селективности и разрешающей способности. разделения по сравнению с другими хроматографическими методами.
Принцип
Аффинная хроматография использует преимущества специфических взаимодействий связывания между представляющим интерес аналитом (обычно растворенным в подвижной фазе ) и партнером связывания или лигандом (иммобилизованным на неподвижной фазе ). В типичном эксперименте по аффинной хроматографии лиганд присоединен к твердой нерастворимой матрице – обычно полимеру, такому как агароза или полиакриламид, – химически модифицированному для введения реакционноспособных функциональных групп, с которыми лиганд может реагировать, образуя стабильные ковалентные связи. Стационарную фазу сначала загружают в колонку, в которую вводят подвижную фазу. Молекулы, которые связываются с лигандом, останутся связанными с неподвижной фазой. Затем применяется промывочный буфер для удаления нецелевых биомолекул путем нарушения их более слабого взаимодействия с неподвижной фазой, в то время как представляющие интерес биомолекулы остаются связанными. Затем биомолекулы-мишени можно удалить с помощью так называемого буфера для элюирования, который нарушает взаимодействия между связанными биомолекулами-мишенями и лигандом. Таким образом, целевая молекула восстанавливается в элюирующем растворе.
Аффинная хроматография не требует знания молекулярной массы, заряда, гидрофобности или других физических свойств интересующего аналита, хотя знание его связывающих свойств полезно при разработке протокола разделения. Типы связывающих взаимодействий, обычно используемые в процедурах аффинной хроматографии, кратко изложены в таблице ниже.
Типичные биологические взаимодействия, используемые в аффинной хроматографии
| Старший Нет | Типы лигандов | Целевая молекула |
|---|---|---|
| 1 | Аналог субстрата | Ферменты |
| 2 | Антитела | Антиген |
| 3 | Лектин | Полисахарид |
| 4 | Нуклеиновая кислота | Дополнительная базовая последовательность |
| 5 | Гормон | Рецептор |
| 6 | Авидин | Биотин / биотин-конъюгированная молекула |
| 7 | Кальмодулин | Партнер связывания кальмодулина |
| 8 | Глутатион | Слитый белок GST |
| 9 | Белки А и G | Иммуноглобулины |
| 10 | Ионы металлов | Слитый белок с поли-гистидином |
Пакетные и колоночные настройки
Периодическая хроматография
Связывание с твердой фазой может быть достигнуто с помощью колоночной хроматографии, при которой твердая среда набивается на колонку, исходная смесь проходит через колонку для осаждения, промывочный буфер проходит через колонку, а буфер для элюирования затем наносится на колонку и собирается. . Эти действия обычно выполняются при атмосферном давлении. В качестве альтернативы связывание может быть достигнуто с использованием периодической обработки, например, путем добавления исходной смеси к твердой фазе в сосуде, перемешивания, разделения твердой фазы, удаления жидкой фазы, промывки, повторного центрифугирования, добавления буфера для элюирования, повторное центрифугирование и удаление элюата.
Иногда используется гибридный метод, при котором связывание осуществляется периодическим методом, но твердая фаза со связанной молекулой-мишенью набивается на колонку, а промывание и элюирование выполняются на колонке.
Лиганды, используемые в аффинной хроматографии, получают как из органических, так и из неорганических источников. Примерами биологических источников являются сывороточные белки, лектины и антитела. Неорганические источники в виде дебильных веществ, хелатов металлов и триазиновых красителей.
Также был разработан третий метод, абсорбция расширенным слоем, который сочетает в себе преимущества двух методов, упомянутых выше. Частицы твердой фазы помещаются в колонну, где жидкая фаза закачивается снизу и выходит наверху. Плотность частиц гарантирует, что твердая фаза не покинет колонну с жидкой фазой.
Аффинные колонки можно элюировать путем изменения концентраций солей, pH, pI, заряда и ионной силы напрямую или с помощью градиента для разделения интересующих частиц.
Совсем недавно были разработаны установки, в которых последовательно используется более одной колонки. Преимущество по сравнению с установками с одной колонкой состоит в том, что материал смолы может быть полностью загружен, поскольку не связывающий продукт напрямую направляется в следующую колонку со свежим материалом колонки. Эти хроматографические процессы известны как периодическая противоточная хроматография (PCC). Таким образом, можно значительно снизить затраты на смолу на количество произведенного продукта. Поскольку одна колонка всегда может быть элюирована и регенерирована, в то время как другая колонка загружена, уже двух колонок достаточно, чтобы в полной мере использовать преимущества. Дополнительные колонки могут дать дополнительную гибкость в отношении времени элюирования и регенерации за счет дополнительного оборудования и затрат на смолу.
Конкретное использование
Аффинная хроматография может использоваться в ряде приложений, включая очистку нуклеиновых кислот, очистку белков из бесклеточных экстрактов и очистку из крови.
Используя аффинную хроматографию, можно отделить белки, которые связывают определенный фрагмент, от белков, которые не связывают этот конкретный фрагмент. Поскольку этот метод очистки основан на биологических свойствах необходимого белка, это полезный метод, и белки можно очищать во много раз за один этап.
Различные медиа по интересам
Существует множество различных аффинити-медиа для множества возможных применений. Вкратце, они (обобщенные) активированные / функционализированные, которые работают как функциональный спейсер, поддерживающая матрица и исключают работу с токсичными реагентами.
Аминокислотные среды используются с множеством сывороточных белков, белков, пептидов и ферментов, а также рРНК и дцДНК. Среда с авидином и биотином используется в процессе очистки биотина / авидина и их производных.
Углеводное связывание чаще всего используется с гликопротеинами или любым другим углеводосодержащим веществом; углевод используется с лектинами, гликопротеинами или любым другим белком-метаболитом углеводов. Среда с красителем-лигандом неспецифична, но имитирует биологические субстраты и белки. Глутатион полезен для разделения рекомбинантных белков, меченных GST. Гепарин – это общий аффинный лиганд, и он наиболее полезен для разделения белков свертывания плазмы, наряду с ферментами нуклеиновых кислот и липазами.
Среды для гидрофобного взаимодействия чаще всего используются для нацеливания на свободные карбоксильные группы и белки.
Иммуноаффинная среда (подробно описанная ниже) использует высокую специфичность антигенов и антител для разделения; аффинная хроматография с иммобилизованным металлом подробно описана ниже и использует взаимодействия между ионами металлов и белками (обычно специально помеченными) для разделения; нуклеотид / кофермент, который разделяет дегидрогеназы, киназы и трансаминазы.
Нуклеиновые кислоты улавливают мРНК, ДНК, рРНК и другие нуклеиновые кислоты / олигонуклеотиды. Метод протеина A / G используется для очистки иммуноглобулинов.
Специальные среды предназначены для определенного класса или типа белка / кофермента; этот тип среды будет работать только для разделения определенного белка или кофермента.
Иммуноаффинность
Еще одно применение процедуры – аффинная очистка антител из сыворотки крови. Если известно, что сыворотка содержит антитела против определенного антигена (например, если сыворотка получена из организма, иммунизированного против соответствующего антигена), то ее можно использовать для аффинной очистки этого антигена. Это также известно как иммуноаффинная хроматография. Например, если организм иммунизирован против слитого с GST белка, он будет продуцировать антитела против слитого белка и, возможно, также антитела против GST-метки. Затем белок может быть ковалентно связан с твердой подложкой, такой как агароза, и использован в качестве аффинного лиганда при очистке антитела из иммунной сыворотки.
Для тщательности каждый из белков GST и слитый с GST белок может быть соединен отдельно. Первоначально сыворотке дают возможность связываться с аффинной матрицей GST. Это удалит антитела против GST части гибридного белка. Затем сыворотку отделяют от твердой подложки и дают возможность связываться с матрицей слитого с GST белка. Это позволяет любым антителам, распознающим антиген, улавливаться на твердой подложке. Элюирование представляющих интерес антител чаще всего достигается с использованием буфера с низким pH, такого как глицин pH 2,8. Элюат собирают в нейтральный трис- или фосфатный буфер, чтобы нейтрализовать элюирующий буфер с низким pH и остановить любое снижение активности антитела. Это хороший пример, поскольку аффинная очистка используется для очистки исходного слитого с GST белка, для удаления нежелательных антител против GST из сыворотки и для очистки целевого антитела.
Моноклональные антитела также могут быть выбраны для связывания белков с высокой специфичностью, когда белок высвобождается в довольно мягких условиях. Это может пригодиться для дальнейших исследований в будущем.
Упрощенная стратегия часто используется для очистки антител, генерируемых против пептидных антигенов . Когда пептидные антигены продуцируются синтетически, концевой остаток цистеина добавляют либо к N-, либо к C-концу пептида. Этот остаток цистеина содержит сульфгидрильную функциональную группу, которая позволяет пептиду легко конъюгировать с белком-носителем (например, гемоцианином лимфы улитки (KLH)). Тот же самый цистеинсодержащий пептид также иммобилизуется на агарозной смоле через остаток цистеина и затем используется для очистки антитела.
Большинство моноклональных антител были очищены с помощью аффинной хроматографии на основе иммуноглобулинового специфического белка A или белка G , полученных из бактерий.
Иммуноаффинная хроматография также является основой для иммунохроматографических тест-полосок (ICT), которые обеспечивают быстрый способ диагностики при лечении пациентов. Используя ИКТ, технический специалист может сделать определение у постели пациента без необходимости в лаборатории. Обнаружение ИКТ очень специфично для микроба, вызывающего инфекцию.
Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов
Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов (IMAC) основана на специфической координационной ковалентной связи аминокислот, в частности гистидина, с металлами. Этот метод работает, позволяя белкам со сродством к ионам металлов удерживаться в колонке, содержащей иммобилизованные ионы металлов, таких как кобальт, никель, медь, для очистки гистидинсодержащих белков или пептидов, железа, цинка или галлия для очистки фосфорилированные белки или пептиды. Многие природные белки не обладают сродством к ионам металлов, поэтому для введения такой белковой метки в соответствующий ген можно использовать технологию рекомбинантной ДНК . Методы, используемые для элюирования представляющего интерес белка, включают изменение pH или добавление конкурирующей молекулы, такой как имидазол .
Хроматографическая колонка с гранулами никель-агарозы, используемая для очистки белков с помощью гистидиновых меток.
Рекомбинантные белки
Возможно, наиболее распространенное применение аффинной хроматографии – очистка рекомбинантных белков. Белки с известной аффинностью помечены белками , чтобы облегчить их очистку. Белок мог быть генетически модифицирован, чтобы позволить его отобрать для аффинного связывания; это известно как гибридный белок. Метки включают гексагистидин ( His ), глутатион- S-трансферазу (GST) и белок, связывающий мальтозу (MBP). Гистидиновые метки обладают сродством к ионам никеля , кобальта , цинка , меди и железа , которые были иммобилизованы за счет образования координационных ковалентных связей с хелатирующим агентом, включенным в неподвижную фазу. Для элюирования используется избыточное количество соединения, способного действовать как лиганд иона металла, такого как имидазол . GST имеет сродство к глутатиону, который коммерчески доступен в иммобилизованном виде в виде глутатион-агарозы. Во время элюирования избыток глутатиона используется для вытеснения меченого белка.
Лектины
Аффинная хроматография с лектином – это форма аффинной хроматографии, при которой лектины используются для разделения компонентов в образце. Лектины, такие как конканавалин A, представляют собой белки, которые могут связывать определенные молекулы углеводов альфа-D-маннозы и альфа-D-глюкозы. Некоторые распространенные молекулы углеводов, которые используются в лектиновой аффинной хроматографии, – это Con A-сефароза и WGA-агароза. Другой пример лектина – агглютинин зародышей пшеницы, который связывает DN-ацетил-глюкозамин. Чаще всего применяется для отделения гликопротеинов от негликозилированных белков или для отделения одной гликоформы от другой гликоформы. Хотя существуют различные способы проведения лектиновой аффинной хроматографии, целью является извлечение сахарного лиганда желаемого белка.
Специальность
Еще одно применение аффинной хроматографии – очистка определенных белков с использованием гелевой матрицы, уникальной для конкретного белка. Например, очистку β-галактозидазы E. coli проводят с помощью аффинной хроматографии с использованием п-аминобенил-1-тио-β-D-галактопиранозилагарозы в качестве аффинной матрицы. п-аминобенил-1-тио-β-D-галактопиранозилагароза используется в качестве аффинной матрицы, поскольку она содержит галактопиранозильную группу, которая служит хорошим аналогом субстрата для E.Coli-B-галактозидазы. Это свойство позволяет ферменту связываться с неподвижной фазой аффинной матрицы и элюируется при добавлении в колонку увеличивающихся концентраций соли.
Щелочная фосфатаза
Щелочная фосфатаза из E. coli может быть очищена с использованием матрицы DEAE-целлюлоза. A. фосфатаза имеет небольшой отрицательный заряд, что позволяет ей слабо связываться с положительно заряженными аминогруппами в матрице. Затем фермент можно элюировать добавлением буфера с более высокими концентрациями соли.
Боронатная аффинная хроматография
Боронатная аффинная хроматография состоит из использования бороновой кислоты или боронатов для элюирования и количественного определения количества гликопротеинов . Клиническая адаптация применила этот тип хроматографии для использования в долгосрочной оценке пациентов с диабетом посредством анализа их гликозилированного гемоглобина .
Очистка сывороточного альбумина
Из многих применений аффинной хроматографии одно ее применение наблюдается в аффинной очистке от загрязнения альбумином и макроглобулином. Этот тип очистки полезен для удаления избытка альбумина и загрязнения α 2 -макроглобулином при проведении масс-спектрометрии. При аффинной очистке сывороточного альбумина стационарным устройством, используемым для сбора или привлечения сывороточных белков, может быть Cibacron Blue-Sepharose. Затем сывороточные белки могут быть элюированы с адсорбента буфером, содержащим тиоцианат (SCN – ).
Слабая аффинная хроматография
Слабая аффинная хроматография (WAC) – это метод аффинной хроматографии для скрининга аффинности при разработке лекарств. WAC – это метод жидкостной хроматографии на основе аффинности, который разделяет химические соединения на основе их различного слабого сродства к иммобилизованной мишени. Чем выше сродство соединения к цели, тем дольше оно остается в блоке разделения, и это будет выражаться как более длительное время удерживания. Измерение аффинности и ранжирование аффинности может быть достигнуто путем обработки полученных значений времени удерживания анализируемых соединений.
Технология WAC продемонстрирована против ряда различных белковых мишеней – протеаз , киназ , шаперонов и мишеней белок-белкового взаимодействия (PPI). Было показано, что WAC более эффективен, чем известные методы для скрининга на основе фрагментов.
Ссылки
внешние ссылки
«Принцип, процедура и предварительное подробное описание аффинной хроматографии – 2020».
Источник