Каким свойством должно обладать иммерсионное масло для микроскопии

Нас часто спрашивают о применении иммерсионного масла. Зачем оно нужно и в каких случаях его необходимо использовать? Мы решили написать об это подробнее – иммерсионное масло применяется с объективами большой кратности. Световые микроскопы имеют верхний предел разрешающей способности незначительно более 1000 крат. На этом уровне увеличении освещение объекта исследования должно быть очень хорошим, в противном случае изображение будет темным, и рассмотреть препарат не получится. В чем же тут дело? А дело в том, что свет преломляется и рассеивается в воздухе между объективом и покровным стеклом. Иммерсионное масло позволяет захватить большее количество света и сделать изображение объекта более четким.

Каким же образом это происходит? В разных средах свет преломляется по-разному, через воздух и через стекло лучи проходят под разными углами. Показатель преломления воздуха – 1.0, стекла – 1.5, и здесь кроется основная проблема. Иммерсионное масло помогает уменьшить преломление лучей света, проходящих через препарат, поскольку оно имеет показатель преломления такой же как и у стекла. Как результат, образуется однородная среда в пространстве между объективом и слайдом, тем самым достигается условие того, что большая часть пройденного через препарат света попадает в объектив микроскопа, обеспечивая формирование более четкого изображения.

Корпус объектива, предназначенного для иммерсии (от лат. immersio — погружение), как правило, имеет гравировку с “Oil”, а сам объектив предназначен для работы в тех случаях, когда нужна апертура 1,0 и более. Кроме того такие объективы используются при непосредственном “погружении” в масло, и поэтому, они изготовлены абсолютно герметично, для предотвращения повреждений линз маслом. 
Иммерсионные масла, как правило, доступны двух вязкостей – низкой вязкости (тип A) и высокой вязкости (тип B). Часто они помечаются коэффициентом преломления, например – 1.515. Масло с низкой вязкостью применяется к воздушному пространству между слайдом и объективом, высокая вязкость масла чаще применяется совместно с конденсорами.

Как правильно использовать масло низкой вязкости?

В большинстве приложений требуется тип масла, которые могут быть использованы следующим образом:

1. Найдите исследуемый объект на слайде в центре поле изображения на малом увеличении, используя объектив самой малой кратности.
2. Поворотом револьверного устройства введите в рабочее положение объектив 100 крат. Поместите одну каплю иммерсионного масла на покровное стекло слайда, и каплю – непосредственно на линзу объектива.
3. Отрегулировать точной фокусировкой рабочее расстояние, до появления четкого изображения объекта. Будьте внимательны, следите за тем, чтобы между объективом и покровным стеклом не попал воздух!

Очистка иммерсионных объективов, после использования.

Очень важно тщательно очистить масло с вашего объектива до его высыхания.

1. Тщательно сотрите масло со всех стеклянных поверхностей при помощи свернутого листа чистой бумаги для очистки линз.
2. Смочите кусок объектив бумагой для очистки объективов с чистящей жидкостью и удалите все остатки масла.

Показатели приломления различных жидкостей, которые применяются для иммерсии:

• Кедровое или минеральное масло (показатель преломления 1,515)
• Водный раствор глицерина (1,434)
• Физиологический раствор (1,3346)
• Вода (1,3329)
• Монобромнафталин (1,656)
• Вазелиновое масло (1,503)
• Йодистый метилен (1,741)

Иммерсионный способ микроскопического наблюдения предполагает введение между объективом прибора и изучаемым объектом специальной жидкости. Она обеспечивает усиление яркости и расширение границ увеличения изображения. Таким образом, объект можно значительно приблизить и рассмотреть самые мелкие его элементы, не меняя оборудования. Соответственно, жидкость именуется иммерсионной. В качестве нее могут выступать самые разные составы. Наиболее популярным считается иммерсионное масло. Рассмотрим его особенности подробнее.

Общие сведения

Первое масло иммерсионное для микроскопии было кедровым. Однако оно имело один существенный недостаток. С течением времени его свойства изменялись, и оно не позволяло получать желаемые результаты. На открытом воздухе жидкость начинала постепенно уплотняться (вплоть до отвердения). Соответственно, изменялся и показатель преломления. В 20 столетии стали выпускать синтетическое иммерсионное масло. У этой жидкости указанного выше недостатка не было.

Иммерсионное масло: стандарты

Ключевые параметры жидкости установлены в ГОСТ 13739-78. Согласно стандарту, иммерсионное масло обладает:

• показателем преломления nd = 1,515±0,001;
• коэффициентом пропускания в спектральном диапазоне от 500 до 700 нм при толщине слоя 1 мм – 95%, от 400 до 480 нм – 92%;

Оптимальной температурой, при которой может применяться иммерсионное масло, считается 20 градусов. Существуют также международные стандарты. В соответствии с ISO 8036/1, показатель преломления составляет 1,518 + 0,0005, а коэффициент пропускания при слое 10 мм для спектрального диапазона от 500 до 760 нм – 95%, а при 400 нм – 60%.

Указанным параметрам соответствует масло иммерсионное нефлуоресцирующее. В стандарте ISO 8036-1/2 определены показатели жидкости для люминесценции. Коэффициент пропускания при спектральном диапазоне от 500 до 700 нм в слое 10 мм составляет 95%, от 365 до 400 нм – 60%.

Сложности расхождений параметров

Выявляемое отличие в указанных выше стандартах может привести к ухудшению работы определенного объектива при использовании несоответствующей ему жидкости. В результате:

1. Снижается контраст вследствие возникновения сферической аберрации.
2. Окрашивается поле на объекте исследования.
3. Освещенность в плоскости изучаемого предмета и на участке формирования его изображения становится неравномерным.
4. Картинка становится нерезкой.

Нюансы

Оптические микроскопы обладают верхним пределом разрешающей способности немного больше 100 крат. На таком уровне увеличения освещение исследуемого предмета должно быть качественным. В противном случае полученное изображение будет настолько темным, что рассмотреть объект будет просто невозможно. Дело в том, что преломление и рассеивание света происходит между покровным стеклом и объективом. Иммерсионное масло способствует большему его захвату. В результате изображение становится более четким.

Особенности преломления света

Как получается четкая картинка? В различных средах преломление света происходит по-разному. Например, углы преломления лучей в воздухе и стекле отличаются. В первом случае показатель 1.0, во втором – 1.5. В этом состоит основная проблема.

Использование масла позволяет уменьшить показатель преломления лучей, которые проходят через исследуемый объект. Дело в том, что жидкость имеет тот же параметр, что и стекло. В результате формируется однородная среда между слайдом и объективом, и большая часть света, проходящего через предмет, попадает в прибор. Так получается четкое изображение.

Технические моменты

Как правило, на корпусах объективов, предназначенных для иммерсии, присутствует гравировка Oil. Сам же элемент используется тогда, когда необходима апертура от 1.0 и более. Такие “иммерсионные” объективы применяются при непосредственном погружении в жидкость. В этой связи они полностью герметичны. Это обеспечивает высокую защиту от повреждения линз маслом.

Классификация

На практике используются масла двух вязкостей: высокой (тип В) и низкой (А). Зачастую на упаковке можно встретить информацию о коэффициенте преломления. К примеру, выпускают масло иммерсионное (100 мл), коэффициент преломления которого равен 1.515. Жидкости, обладающие низкой вязкостью, применяют к воздушному пространству, а с высокой – вместе с конденсорами.

Правила использования

Чтобы получить четкое изображение исследуемого объекта, нужно следовать достаточно простым рекомендациям:

1. Найти изучаемый предмет на слайдере по центру поля на небольшом увеличении. Для этого используется объектив малой кратности.
2. Повернуть револьверное устройство.
3. Ввести объектив 100 крат в рабочее положение.
4. Поместить каплю масла на стекло слайда, вторую – на линзу.
5. Отрегулировать рабочее расстояние точной фокусировкой до появления четкой картинки объекта.

При работе необходимо соблюдать осторожность. Важно не допустить попадание воздуха между покровным стеклом и объективом.

Масло иммерсионное “Минимед”

Жидкость применяется при работе с ахроматическими и апохроматическими объективами любого типа приборов, кроме люминесцентных. Как отмечают специалисты, использовавшие это иммерсионное масло, оно обладает несколькими полезными свойствами. Жидкость существенно улучшает видимость объекта, минимизирует блики, потерю света и аберрации оптики. Применение масла значительно расширяет диапазон возможностей оборудования.

Очистка оборудования

После работы с иммерсионным маслом необходимо привести в порядок прибор. Очистку нужно осуществлять до того, как объектив высохнет. Для удаления остатков масла используется чистая бумага для линз. Свернутым листом очищают все стеклянные поверхности. Бумагу для объективов следует смочить специальным раствором и удалить остатки масла.

Историческая справка

Первым ученым, объяснившим механизм иммерсии, был Роберт Гук. В 1678 г. вышла его книга Microscopium, в которой были даны все пояснения. В 1812 г. иммерсия была предложена в качестве средства исправления аберраций объектива. Автором идеи стал Дэвид Бюстер. Приблизительно в 1840 г. были изготовлены первые иммерсионные объективы. Создателем их являлся Д.Б. Амичи. Изначально в качестве иммерсионной жидкости исследователи использовали анисовые масла. Показатель преломления был приближен к таковому у стекла.

31 марта 2014

В оптических микроскопах могут использоваться сухие и иммерсионные объективы. Но, если с сухим объективом все более или менее понятно, то о применении иммерсионного объектива, нужно сказать отдельно.

Иммерсионным объективом, называют такой объектив, на который для увеличения резкости и повышения яркости исследуемого объекта, а также для расширения пределов изображения, наносят специальное масло. Иммерсионное масло находится в пространстве между первой линзой (конденсором) и предметным стеклом.

Почему улучшается качество изображения объекта? Потому что преломление лучей в воздухе ниже, чем при их прохождении через жидкие среды. Кроме того, не происходит рассеивание лучей, а значит, удается повысить контраст отдельных частей исследуемого объекта и глубину просмотра.

В качестве масла для иммерсии используются различные вещества. Почти все они имеют маслянистые свойства, например, первой жидкостью для таких объективов было кедровое масло, затем стали использовать синтетические масла и глицерин, добавленный в воду. Существует также методика работы с водными иммерсионными объективами. В настоящий момент производители микроскопов рекомендуют использовать только те иммерсионные жидкости, которые прилагаются к конкретному изделию. Замена одного масла на другое может привести к ухудшению качества изображения, появлению бликов и сферических аберраций, неравномерности освещения исследуемого объекта.

Масляные и водные иммерсионные объективы применяются при исследовании объектов через световой микроскоп, а водно-глицериновая иммерсия нужна в том случае, когда изучаемый объект сильно поглощает ультрафиолетовый свет.

Какова должна быть последовательность действий при нанесении иммерсии?

Если работать с масляной иммерсией, то вначале на исследуемый образец капают монтирующую жидкость, накрывают препарат покровным стеклом. И только после этого, на покровное стекло наносят иммерсионное масло. Кстати, у объективов, предназначенных для работы с масляной иммерсией, стоит маркировка – черная полоска возле фронтальной оправы и надпись «МИ» или «Oil».

Для работы с водной иммерсией на исследуемый препарат наносят каплю фосфатного буферного раствора, а саму микроскопию производят с объективом для водной иммерсии (он имеет белую полосу возле фронтального компонента и буквенную маркировку «ВИ» или «W»).

Несколько слов о том, какие виды иммерсионного масла существуют.

Производители выпускают иммерсионное масло А (классическое) и Б (профессиональное). Разница между нм состоит в том, что первый вид масла используется во время работы с апохроматическими и ахроматическими объективами, однако оно не используется в работе с люминесцентными объективами. Кроме того, масло типа А не комплектуется системой визуализации изображения. Масло типа Б, напротив, укомплектовано системой визуализации, и предназначается, в первую очередь, для работы в условиях искусственного освещения. Этот вид масла менее вязкий и обеспечивает большее пропускание светового потока.

По окончании работы с иммерсией, объектив необходимо обязательно очистить мягкой салфеткой или ватой, смоченной в этиловом ли изопропиловом спирте. Нельзя допускать нагревания масла выше 25°С, а также его замерзания. Оптимальная рабочая температура составляет от 20 до 24°С. По окончании срока годности масло использовать не рекомендуется.