Какие свойства белков изменяются при денатурации

Нативная конформация белковых молекул не является жесткой, она довольно лабильна (от лат. labilis — скользящий) и при ряде воздействий может серьезно нарушаться. Денатурацией (от лат. denaturare — лишать природных свойств) белка называется такое нарушение его нативной конформации, которое сопровождается изменением его нативных свойств, но не разрывом пептидных связей.

Таким образом, денатурация белка может быть вызвана различными относительно мягкими воздействиями, приводящими к нарушению в его молекулах слабых взаимодействий — водородных, ионных связей и гидрофобных контактов, а также к разрыву ди- сульфидных связей, стабилизирующих нативную структуру белка. При этом нарушаются вторичная, третичная и четвертичная структуры белковых молекул, но не нарушаются ковалентные связи в полипептидной цепи, следовательно, не нарушается первичная структура белка.

К нарушению различных связей в большинстве белков приводит прежде всего их нагревание до температуры выше 50 °С, а также ультрафиолетовое и другие виды высокоэнергетического облучения, что обусловлено усилением колебаний атомов полипептидной цепи. Денатурацию белка способны вызвать даже механические воздействия, например сильное взбалтывание раствора белка.

Скорость и степень денатурации белков при нагревании прямо зависят от температуры нагревания и его продолжительности, а также от влажности белка: в водном растворе белки денатурируют гораздо быстрее, чем в высушенном состоянии.

Денатурация белков также может происходить вследствие какого- либо химического воздействия, например в присутствии некоторых органических растворителей (спирта, ацетона и др.), мочевины, ионов тяжелых металлов и др., а также в условиях экстремальных значений pH среды.

Сильные кислоты или щелочи влияют на ионизацию кислотных и основных групп, вызывая нарушение ионных и некоторых водородных связей в молекулах белков. Напоминающая своей структурой пептидные группы молекула мочевины (H2N-CO-NH2) конкурирует с этими и другими группами в белках за образование водородных связей, нарушая их систему. Органические растворители — спирты, фенолы и другие — также нарушают в белках систему водородных связей в результате конкуренции с функциональными группами белков за их образование. Кроме этого, органические растворители вследствие установления контактов с неполярными радикалами остатков аминокислот нарушают в белках гидрофобные взаимодействия. Высокие концентрации мочевины или органических растворителей вызывают нарушение структуры воды, что также приводит к ослаблению в белковых молекулах гидрофобных взаимодействий. Слабые взаимодействия нарушают и ионы тяжелых металлов.

Дисульфидные связи в белках разрушает 2-меркаптоэтанол:

При денатурации происходит изменение свойств белка и, в первую очередь, уменьшение его растворимости. Так, при кипячении белки коагулируют и выпадают из растворов в осадок в виде сгустков. Это происходит, например, при варке куриного яйца: если медленно нагревать яичный альбумин (белок яйца), он постепенно мутнеет и, наконец, превращается в вязкий сгусток (коагулирует). После охлаждения этот белок оказывается нерастворимым. Это изменение растворимости белка является необратимым.

Осаждение белков из растворов происходит также под воздействием белковых осадителей, в качестве которых применяют реактив Барнштейна (смесь растворов гидроксида натрия и сульфата меди), раствор трихлоруксусной кислоты, уксуснокислого свинца, таннина или др.

В процессе денатурации трехмерная структура белковой молекулы нарушается, полипептидная цепь полностью или частично развертывается, молекула приобретает гораздо более рыхлую структуру. Вследствие этого повышается вязкость данного белка в растворе. Кроме того, при денатурации уменьшается водопоглотительная способность белка, т.е. его способность к набуханию; могут появляться новые химические группы, например при воздействии 2-меркаптоэтанол а — SH-группы.

Так как специфические биологические функции белка возникают на уровне его третичной или четвертичной структуры, то денатурация, сопровождающаяся нарушением этих уровней структурной организации белка, приводит к частичной или полной потере белком своей биологической активности. Например, если воздействовать на находящийся в растворе фермент трипсин возрастающими концентрациями мочевины (типичного денатурирующего агента), то по мере нарушения его вторичной и третичной структур, которое сопровождается возрастанием характеристической вязкости раствора, происходит одновременное ослабление его каталитической функции; в конце концов фермент свою функцию полностью утрачивает. Если же мочевину постепенно удалить из раствора, например методом диализа, то происходит ренатурация денатурированного белка: нативная структура, а вместе с ней и каталитическая функция трипсина восстанавливаются.

Этот опыт является примером обратимой денатурации белков, при которой их нативная конформация и нативные свойства могут быть в той или иной степени восстановлены, если убрать из среды денатурирующий агент.

Однако хотя первичная структура белка при денатурации не нарушается, денатурационные изменения в белках в большинстве случаев являются необратимыми. Примером необратимой денатурации могут служить изменения, происходящие с белком куриного яйца при его варке.

Денатурация белков имеет большое значение в явлениях живого мира. Так, по мере старения организмов происходит постепенная, хотя и очень медленная, денатурация белков, сопровождающаяся снижением их гидрофильности. Примером подобной необратимой денатурации является старение семян, которые, даже при наиболее благоприятных условиях хранения, в конце концов, теряют способность к прорастанию.

Денатурация белков имеет место и очень важна в целом ряде процессов пищевой промышленности — при выпечке хлеба и кондитерских изделий, сушке макарон, изготовлении консервов и т.д. Денатурированные (частично разрушенные) белки, как правило, значительно легче усваиваются организмом, так как в процессе пищеварения они легче гидролизуются под воздействием специфических катализаторов — ферментов. Следовательно, денатурация белков, происходящая в ходе производства пищевых продуктов, а также приготовления пищи, имеет положительное значение, так как в результате нее повышается степень усвоения белков.

Денатурация белков. Деструкция белков.

Важное свойство белков – их способность к денатурации. Этим понятием обозначают явления, связанные с необратимым изменением вторичной, третичной и четвертичной структур белка под воздействием нагревания, кислот, щелочей, УФ-лучей, ионизирующей радиации, ультразвука и др. Иными словами, денатурация – это необратимое нарушение нативной пространственной конфигурации белковой молекулы, сопровождающееся существенными изменениями биологических и физико-химических свойств белков.

Поскольку в образовании вторичной и третичной структур частично участвуют относительно слабые связи, физическое состояние белка в значительной степени зависит от температуры, pH, присутствия солей и других факторов. Нагревание, например, вызывает распрямление полипептидной цепи белковой молекулы; некоторые химические реагенты разрывают водородные связи. Изменение pH также обусловливает разрыв связей, при этом проявляется электростатическая неустойчивость.

Белки под влиянием различных физических и химических факторов теряют свои первоначальные (нативные) свойства. Внешне это выражается в их свертывании и выпадении в осадок. Примером такого явления может служить свертывание альбумина молока при кипячении. Негидролитическое необратимое нарушение нативной структуры белка и называется денатурацией. При этом рвутся в основном водородные связи, изменяется пространственная структура белка, однако разрыва ковалентных связей в белковой молекуле не происходит.

Денатурация приводит к развертыванию молекулы белка, и он переходит в более или менее разупорядоченное состояние (в нем уже нет ни спиралей, ни слоев, ни других каких-либо видов регулярной укладки цепи). В денатурированном состоянии амидные группы пептидной цепи образуют водородные связи с окружающими их молекулами воды; таких водородных связей значительно больше, чем внутримолекулярных.

Взбивание яичного белка, сливок превращает их в пену, состоящую из пузырьков воздуха, окруженных тонкими белковыми пленками, образование которых сопровождается развертыванием полипептидных цепей в результате разрыва связей при механическом воздействии. Таким образом, при образовании пленок происходит частичная или полная денатурация белка. Такой вид денатурации называется поверхностной денатурацией белка.

Для кулинарных процессов особое значение имеет тепловая денатурация белков. Механизм тепловой денатурации белков можно рассмотреть на примере глобулярных белков.

Основная молекула глобулярного белка состоит из одной или нескольких полипептидных цепей, сложенных складками и образующих клубки. Такая структура стабилизируется непрочными связями, среди которых большую роль играют водородные связи, образующие поперечные мостики между параллельными пептидными цепями или их складками.

При нагревании белков начинается усиленное движение полипептидных цепей или складок, что приводит к разрыву непрочных связей между ними. Белок разворачивается и приобретает необычную, неприродную форму, водородные и другие связи устанавливаются в несвойственных данной молекуле местах, и конфигурация молекулы меняется. В результате происходит развертывание и перегруппировка складок, сопровождаемые перераспределением полярных и неполярных групп, причем неполярные радикалы концентрируются на поверхности глобул, понижая их гидрофильность. При денатурации белки становятся нерастворимыми и в большей или меньшей мере утрачивают способность к набуханию.

При тепловой денатурации белков активная роль принадлежит воде, которая участвует в образовании новой конформационной структуры денатурированного белка. Полностью обезвоженные белки не денатурируют даже при длительном нагревании. Денатурирующий эффект внешних воздействий тем сильнее, чем выше гидратация белков и ниже их концентрация в растворе.

При значениях pH среды, близких к ИЭТ белка, происходит максимальная дегидратация белка. Наиболее полно денатурация осуществляется в ИЭТ белка. Смещение pH в ту или иную сторону от ИЭТ белка способствует повышению его термостабильности и ослаблению денатурационных процессов.

Температура денатурации белков повышается в присутствии других термостабильных белков и некоторых веществ небелковой природы, например сахарозы. Это свойство белков используют, когда при тепловой обработке необходимо повышение температуры смеси (например, при пастеризации мороженого, изготовлении яично-масляных кремов), не допуская расслоения или структурообразования в белковой коллоидной системе.

Появление на поверхности белковой молекулы после денатурации ранее скрытых радикалов или функциональных групп изменяет физико-химические и биологические свойства белков. В результате денатурации свойства белков необратимо изменяются.

Из прогретой муки нельзя приготовить тесто, а из вареного мяса – котлеты, так как денатурированные белки не обладают способностью к гидратации и образованию вязких упруго-пластичных масс, пригодных для формования полуфабрикатов.

Потеря способности к гидратации объясняется утратой белками нативных свойств, важнейшим из которых является выраженная гидрофильность (большое сродство к воде), и связана с изменением конформации полипептидных цепей в белковой молекуле в результате денатурации.

Набухание и растворимость белков в воде обусловлены наличием на поверхности белковых молекул большого числа гидрофильных групп (СООН, ОН, NH2), способных связывать значительное количество воды.

Как уже отмечалось, способность разных нативных белков пищевых продуктов растворяться в каком-либо растворителе (воде, растворах нейтральных солей, слабых растворах щелочей, спирте и др.) используют для разделения или выделения определенной белковой фракции (для исследовательских или пищевых целей). Денатурированные белки такими различиями не обладают, они все одинаково нерастворимы и не способны набухать в воде. Исключение из этого общего правила составляет фибриллярный коллаген мяса и рыбы, который после тепловой денатурации и деструкции до глютина способен растворяться в горячей воде.

В результате денатурации белки теряют биологическую активность. В растительном и животном сырье, используемом на предприятиях общественного питания, активность большинства белковых веществ сохраняется. Так, в результате деятельности ферментов плоды при хранении дозревают (а иногда и перезревают), картофель и корнеплоды прорастают. Особенно наглядно деятельность ферментов проявляется в клубнях картофеля при хранении их на свету: поверхность клубней приобретает зеленую окраску и горький вкус соответственно в результате синтеза хлорофилла и образования ядовитого гликозида соланина.

В сыром мясе тканевые ферменты также находятся в активном состоянии, участвуя в автолизе мяса (послеубойном созревании). Это их свойство используют для практических целей. Полная инактивация кислой фосфатазы происходит при достижении температуры в геометрическом центре мясного изделия 80 °С, что соответствует температуре пастеризации (отмиранию вегетативных форм бактерий). При необходимости проверить достаточность тепловой кулинарной обработки мясного изделия определяют наличие или отсутствие в нем активной кислой фосфатазы.

В нативном белке пептидные группы экранированы внешней гидратной оболочкой или находятся внутри белковой глобулы и таким образом защищены от внешних воздействий. При денатурации белок теряет гидратную оболочку, что облегчает доступ пищеварительным ферментам желудочно-кишечного тракта к функциональным группам. Белок переваривается быстрее.

Кроме того, иногда ингибиторная функция белка исчезает после денатурации. Так, некоторые белки яйца отрицательно влияют на процесс пищеварения: авидин в кишечнике связывает биотин (витамин Н), который участвует в регуляции нервной системы и нервно-рефлекторной деятельности; овомукоид угнетает действие трипсина (фермента поджелудочной железы). Именно поэтому белки сырого яйца не только плохо перевариваются, но и частично всасываются в непереваренном виде, что может вызвать аллергию, уменьшить усвояемость других компонентов пищи и ухудшить всасывание соединений кальция. При денатурации эти белки утрачивают свои антиферментные свойства.

При денатурации белок теряет гидратную оболочку, в результате чего многие функциональные группы и пептидные связи белковой молекулы оказываются на поверхности и белок становится более реакционноспособным.

В результате тепловой денатурации белка происходит агрегирование белковых молекул. Поскольку гидратная оболочка вокруг молекулы белка нарушается, отдельные молекулы белка соединяются между собой в более крупные частицы и уже не могут держаться в растворе. Начинается процесс свертывания белков, в результате которого образуются новые молекулярные связи.

Взаимодействие денатурированных молекул белка в растворах и гелях протекает по-разному. В слабоконцентрированных белковых растворах при тепловой денатурации агрегация молекул белка происходит путем образования межмолекулярных связей как прочных, например дисульфидных, так и слабых (но многочисленных) – водородных. В результате образуются крупные частицы. Дальнейшая агрегация частиц приводит к расслоению коллоидной системы, образованию хлопьев белка, выпадающих в осадок или всплывающих на поверхность жидкости, часто с образованием пены (например, выпадение в осадок хлопьев денатурированного лактоальбумина при кипячении молока; образование хлопьев и пены из денатурирующих белков на поверхности мясных и рыбных бульонов). Концентрация белков в таких растворах не превышает 1 %.

В более концентрированных белковых растворах при денатурации белков образуется сплошной гель, удерживающий всю воду, содержащуюся в коллоидной системе. В результате агрегации денатурированных молекул белка образуется структурированная белковая система. Денатурация белков в концентрированных растворах с образованием сплошного геля происходит при тепловой обработке мяса, рыбы (белки саркоплазмы), куриных яиц и разных смесей на их основе. Точные концентрации белков, при которых их растворы в результате нагревания образуют сплошной гель, неизвестны. Учитывая, что способность к гелеобразованию у белков зависит от конфигурации (асимметрии) молекул и характера образующихся при этом межмолекулярных связей, надо полагать, что для разных белков указанные концентрации различны.

Например, для приготовления омлетов к яичному меланжу добавляют 38…75 % молока. Нижние пределы относятся к омлетам жареным, верхние — к вареным на пару. Для приготовления омлетов из яичного белка, используемых в диетическом питании, молоко добавляют в количестве 40 % независимо от способа тепловой обработки, так как в белке яйца концентрация белков значительно ниже, чем в желтке.

Некоторые белки, представляющие собой более или менее обводненные гели, при денатурации уплотняются, в результате чего происходит их дегидратация с отделением жидкости в окружающую среду. Белковый гель, подвергшийся нагреванию, как правило, характеризуется меньшим объемом, массой, пластичностью, повышенной механической прочностью и большей упругостью по сравнению с исходным гелем нативных белков. Подобные изменения белков наблюдаются при тепловой обработке мяса, рыбы (белки миофибрилл), варке круп, бобовых, макаронных изделий, выпечке изделий из теста.

Гелями и студнями называются твердообразные нетекучие структурированные системы, образовавшиеся в результате действия молекулярных сил сцепления между коллоидными частицами или макромолекулами полимеров. Ячейки пространственных сеток гелей и студней обычно заполнены растворителем.

Таким образом, гели представляют собой коллоидные системы или растворы высокомолекулярных соединений (ВМС), утратившие текучесть из-за возникновения в них определенных внутренних структур в виде пространственного сетчатого каркаса, ячейки которого заполнены дисперсионной средой. Поскольку заключенная в ячейках дисперсионная среда при этом теряет свою подвижность, ее называют иммобилизированной.

Гели весьма широко распространены в природе: к ним относятся многие строительные материалы (бетоны, цементы, глинистые суспензии), грунты, некоторые минералы (агат, опал), различные пищевые продукты (мука, тесто, хлеб, желе, мармелад, студень), желатин, каучук, ткани живых организмов и многие другие материалы живой и неживой природы.

В зависимости от концентрации дисперсионной среды гели принято подразделять на лиогели, коагели и ксерогели (аэрогели).

Богатые жидкостью гели, содержащие мало сухого вещества (до 1-2 %), называют диогелями. К типичным диогелям относятся кисель, студень (холодец), простокваша, растворы мыл и др.

Студенистые осадки, получаемые в процессе коагуляции некоторых гидрофобных золей, а также хлопьевидные осадки, образующиеся при высаливании растворов ВМС, называются коагелями. Содержание сухого вещества в коагелях достигает 80 %. Однако очень бедные жидкостью хлопья и микрокристаллические порошки, образующиеся при коагуляции типичных гидрофобных коллоидов (гидрозолей золота, серебра, платины, сульфидов) к коагелям не относятся.

Бедные жидкостью или совсем сухие гели называются ксерогелями. Примерами ксерогелей могут служить сухой листовой желатин, столярный клей в плитках, крахмал, каучук. К сложным ксерогелям относят многие пищевые продукты (муку, сухари, печенье). Высокопористые ксерогели называют также аэрогелями, поскольку в них дисперсионной средой служит воздух. К аэрогелям относят многие сорбенты (силикагель), твердые катализаторы химических реакций.

В зависимости от природы дисперсной фазы и по способности к набуханию принято различать гели хрупкие и эластичные. Эластичные гели мы будем называть студнями.