Какие среды служат для изучения ферментативных свойств микробов

Для определения сахаролитических свойств из углеводов обычно используют лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, маннит. Результат реакции определяется при помощи добавляемых в питательную среду различных индикаторов, дающих цветные реакции. Поэтому метод посева на дифференциально-диагностические среды получил название посева на пестрый ряд. Иногда, в так называемый длинный пестрый ряд, добавляют арабинозу, ксилозу, галактозу, инулин, крахмал и др.

При разложении углеводов происходит образование органических кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газа (СО2 и Н2). Кислоты вызывают изменение рН среды, что приводит к из­менению ее цвета в результате реакции индикатора. Образую­щийся газ вытесняет жидкость в верхней части поплавка (при ис­пользовании жидкого пестрого ряда) или вызывает разрыв агара (при применении полужидких сахаров).

Среды для определения сахаролитических свойств

Среды Гисса состоят из пептонной воды, 1% углевода и ин­дикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации запол­няется средой. При сбраживании сахара бактериями, цвет среды меняется на красный, а газ скапливается в поплавке.

Полужидкие сахара состоят из 0,7% мясопептонного агара, 1% сахара и индикатора рН (водно-голубая краска и розоловая кислота). Посев производится уколом. При ферментации сахара цвет среды становится голубым, при наличии газообразования по ходу посева видны пузырьки газа, сам агар разрывается. В ла­бораторной практике широко применяются и другие дифферен­циально-диагностические среды, в состав которых входят сахара.

Протеолитические свойства бактерий (расщепление белков) определяются обнаружениемконечных продуктов ферментации белков (индола, сероводорода, аммиака) и по способности раз­жижать желатину (мясопептонный бульон с 10-15% желатин).

Разжижать желатину способны микробы, выделяющие фер­мент типаколлагеназы. Процесс разжижения идет сверху, при­чем различные виды микробов дают характерную для них фор­му, потому это свойство также используется в целях идентифи­кации бактерий.

Определение ферментации белков по конечным продуктам распада проводится при посеве на мясопептонный бульон или пептонную воду.

Таким образом, завершая работу по выделению чистой культуры, мы имеем данные о морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойствах выделенных культур бактерий. Это дает основание приступить к видовой идентификации – основной задаче последнего этапа бактерио­логического исследования. Для этого используют определитель Берги. Это справочное издание, каталог бактерий. В нем все микроорганизмы сгруппированы по основным биологическим свойствам. Сопо­ставляя свойства выделенных культур с приведенными в опреде­лителе, устанавливают их принадлежность к группе, семейству, ро­ду и, наконец, виду.

По морфологии, типу дыхания, тинкториальным свойствам, способности к спорообразованию находят таксономическую группу для идентифицируемой культуры. По полным морфологическим, тинкториальным свойствам, типу дыхания, спорообразованию, культуральным свойствам и неко­торым биохимическим признакам находят семейство, по методо­логическим особенностям (наличие капсул, жгутиков и т.д.), культуральным и биохимическим признакам определяют род, а внут­ри рода по биохимическим и антигенным свойствам устанавли­вают вид.

Cамостоятельная работа студента

На практическом занятии

Контрольные вопросы

1. Питание бактерий: аутотрофы и гетеротрофы.

2. Классификация питательных сред.

3. Условия культивирования микробов.

4. Требования, предъявляемые к питательным средам.

5. Химический состав микробов.

6. Понятие о чистой культуре и колониях.

7. Методы выделения чистых культур аэробных микробов.

8. Этапы выделения чистой культуры аэробных бактерий.

9. Культуральные свойства бактерий.

10. Биологическое окисление у аэробных и анаэробных бактерий.

11. Методы культивирования анаэробов.

12. Методы выделения чистых культур анаэробов.

13. Значение ферментов в идентификации бактерий.

Тема:«Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Действие физических и химических факторов. Стерилизация и дезинфекция»

Цель:

– научиться методам стерилизации лабораторной по­суды и

питательных сред.

Задачи:

– уметь правильно подобрать соответствующий метод стерилизации

различных объектов (среда, посуда, инструменты и т.д.);

– освоить основные группы дезинфицирующих ве­ществ и механизм

их действия на бактерии.

Во внешней среде на микробы действуют физические, хими­ческие и биологические факторы, которые или угнетают, или стимулирует их жизнедеятельность.

К физическим факторам относятся: высокая и низкая темпе­ратура, высушивание, лучистая энергия, ультразвук, высокое давление.

Температура. Физиологическая деятельность любого микроорганизма приспособлена к определенному температурному оптимуму. По отношению к температуре все микроорганизмы делятся на психрофилы (от 0 до +10°С), мезофилы (от +20°С до +40°С) и термофилы (+50°С – +70°С). Большинство патогенных микроорганизмов относится к мезофилам.

Большинство микроорганизмов устойчивы к низким температурам (исключение составляют гонококки и менингококки). Высокая температура (+50°С – +60°С) губительно действует на вегетативные формы бактерий. Споры выдерживают кипячение до 2 часов. Губительное действие высокой температуры и лежит в основе методов стерилизации.

Основные противоэпидемические мероприятия

В лаборатории

Стерилизация

Стерилизация – удаление или уничтожение всех живых микроорганизмов (вегетативных и споровых форм) внутри или на поверхности предметов.

Стерилизация проводится различными методами: физическими, химическими,механическими.

Основные требования, предъявляемые к процессу стерилизации, отражены в отраслевом стандарте 42-21-2-82 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства, режимы».

Физические методы

Самым распространенным методом стерилизации является воздействие высокой температуры. При температуре, приближающейся к 100 °С, происходит гибель большинства патогенных бактерий и вирусов. Споры почвенных бактерий-термофилов погибают при кипячении в течение 8,5 часов. Микроорганизмы, попавшие в глубинные слои земли, или покрытые свернувшейся кровью, оказываются защищенными от воздействия высокой температуры и сохраняют свою жизнеспособность.

При стерилизации физическими методами применяют действие высоких температур, давления, ультрафиолетового облучения и др.

Наиболее простой, но надежный вид стерилизации – прокаливание. Его применяют при поверхностной стерилизации негорючих и теплоустойчивых предметов непосредственно перед их использованием.

Другим простым и легко доступным методом стерилизации считается кипячение. Этот процесс проводят в стерилизаторе — металлической коробке прямоугольной формы с двумя ручками и плотно закрывающейся крышкой. Внутри расположена вынимающаяся металлическая сетка с ручками по бокам, на которую кладут стерилизуемый инструмент. Основной недостаток метода заключается в том, что он не уничтожает споры, а только вегетативные формы.

При паровой стерилизации необходимо выполнение определенных условий, которые гарантируют ее эффективность и сохранение стерильности изделий в течение определенного срока. Прежде всего, стерилизация инструментов, операционного белья, перевязочного материала должна проводиться в упаковке. С этой целью используют: стерилизационные коробки (биксы), двойную мягкую упаковку из бязи, пергамент, влагопрочную бумагу (крафт-бумага), полиэтилен высокой плотности.

Обязательное требование к упаковке – герметичность. Сроки сохранения стерильности зависят от вида упаковки и составляют трое суток для изделий простерилизованных в коробках без фильтров, в двойной мягкой упаковке из бязи, бумаги мешочной влагопрочной. В стерилизационных коробках с фильтрами стерильность изделий сохраняется в течение года.

Стерилизация сухим жаром

Процесс стерилизации сухим жаром проводят в сухожаровом шкафу (в печи Пастера и др.) – металлическом шкафу с двойными стенками. В корпусе шкафа расположены рабочая камера, в которой имеются полки для размещения предметов для обработки, и нагревательные элементы, которые служат дляравномерного нагрева воздуха в рабочей камере.

Режимы стерилизации:

температура 150 °С – 2 часа;

температура 160 °С – 170 °С – 45 минут – 1час;

температура 180 °С – 30 минут;

температура 200 °С – 10-15 минут.

Необходимо помнить, что при температуре 160 °С бумага и вата желтеют при более высокой температуре — сгорают (обугливаются). Началом стерилизации является тот момент, когда температура в печи достигает нужной величины. После окончания стерилизации печь выключается, прибор остывает до 50 °С, после чего из него вынимают простерилизованные предметы.

Изделия в воздушном стерилизаторе можно стерилизовать без упаковки, но только в тех случаях, если они используются сразу же после стерилизации. В качестве упаковки может быть использована бумага мешочная, изготовленная по ГОСТ 2228-81, в ней изделия хранятся не менее 3-х суток.

Режим воздушной стерилизации представлен двумя значениями температуры – 160 °С в течение 2,5 часов, либо 180 °С – в течение 1 часа.

Стерилизация текучим паром

Этот вид стерилизации производится в аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Кохапредставляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата не плотно, для того,чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта его с паром. Начальный подогрев воды в приборе происходит в течение 10-15 минут.

Текучим паром стерилизуют материалы, которые разлагаются или портятся при температуре выше 100 °С – питательные среды с углеводами, витаминами, растворы углеводов и т. п.

Стерилизацию текучим паром проводят дробным методом – при температуре не выше 100 оС по 20-30 минут в течение 3-х дней. При этомвегетативные формы бактерий погибают, а споры сохраняют жизнеспособность и прорастают в течение суток при комнатной температуре. Последующее прогревание обеспечивает гибель этих вегетативных клеток, появляющихся из спор в промежутках между этапами стерилизации.

Тиндализация – метод дробной стерилизации, при котором прогревание стерилизуемого материала проводится при температуре 56-58 оС в течение часа 5-6 дней подряд.

Пастеризация – однократное нагревание материала до 50-65 °С (в течение 15-30 минут), 70-80 °С (в течение 5-10 минут). Используется для уничтожения бесспоровых форм микробов в пищевых продуктах (молоко, соки, вино, пиво).



Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации (отличия) и идентификации (определения вида) бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.

Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).

Каталаза – фермент, расщепляющий Н2О2 с образованием водорода и кислорода. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н2О2.

Цитохромоксидазу обнаруживают так: смачивают реактивом бумажку и наносят суточную культуру микроорганизмов. Получается синее окрашивание.

Среди ферментов гидролаз изучаются ферменты, расщепляющие углеводы (или сахара) и ферменты, расщепляющие белки (или протеины). Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитическими свойствами, а способность расщеплять белки – протеолитическими свойствами.

Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления после посева на определенные среды.. При распаде сахаров определяют образование кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газов (СО2 или Н2 ), а при распаде белков – образование щелочей, H2S, NH3.

Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий.

Изучение сахаролитических свойств.

Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева,а такжежидкие и полужидкие среды Гисса.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор.

Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки – E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо – красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.

Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды – розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.

Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается “пестрый ряд”. Каждый вид бактерий характеризуется своим “пестрым рядом”.

Изучение протеолитических свойств.

Протеолитические свойства бактерий изучают:

а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент – коллагеназа;

б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н2S, NH3.

Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола – щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н2S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH3 – лакмусовая бумажка (синий цвет).

Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др.

Словарик.

ВНЕДРИТЬСЯ ВО ЧТО-ЛИБО – войти, укрепиться в чем-нибудь, (несов.) внедряться.

ВЫГОДА –польза, преимущество, (нареч.) выгодно.

МУТНЫЙ –непрозрачный, нечистый. Мутный раствор.

РАСЩЕПЛЕНИЕ =деление на части.

РАСПАД =деление чего на что.

ИСХОДНЫЙ ЦВЕТ =первоначальный цвет.

Однократно –один раз.

ДЛИТЕЛЬНО = ДОЛГО.

ЛЕКЦИЯ № 6

Культивирование бактерий и вирусов.

Культивирование – искусственное выращивание микроорганизмов. Используется для изучения свойств микроорганизмов и для диагностики инфекционных заболеваний.

Культивирование бактерий.

Для культивирования необходимо: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О2) или создание бескислородных условий для анаэробов; 4) определенной время для выращивания (чаще – 24 час).

Требования к питательным средам.

а) среды должны быть питательными – содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества;

б) иметь определенное значение рН; для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4;

в) обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы не изменялось значение рН среды;

г) быть изотоничными – осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки;

д) быть стерильными для получения чистой культуры;

е) содержать достаточное количество Н2О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии;

ж) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, для аэробов rH2 – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5;

з) быть прозрачными;

Классификация питательных сред.

По консистенции среды делят на:

а) жидкие: пептонная вода (ПВ), мясопептонный бульон (МПБ);

б) полужидкие: полужидкий мясопептонный агар (МПА) и др.;

в) плотные или твердые: МПА, мясопептонный желатин, свернутая сыворотка;

г) сыпучие: разваренное пшено, кварцевый песок;

д) сухие – гигроскопические порошки, выпускаемые промышленностью;

Для уплотнения сред используют агар, желатин или селикагель. Агар – полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он образует в воде гели, которые плавятся при температуре 100° С и застывают при 45° С. К полужидким средам агар добавляют в количестве 0,5% (0,3-0,7%), к плотным – 1,5-2%.

По составу среды делят на:

а) естественные – натуральные продукты (яйца, овощи), животные ткани, желчь, сыворотка крови;

б) искусственные – среды, приготовленные из различных настоев или отваров с добавлением неорганических солей, углеводов, азотистых веществ;

в) синтетические – среды, приготовленные из определенных химических соединений в точно указанных концентрациях.

По назначению среды делят на:

а) основные (простые) – используют для культивирования многих видов микроорганизмов: ПВ, МПБ, МПА; на простых средах хорошо растут прототрофные бактерии; простые среды служат основой для приготовления ряда сложных питательных сред;

б) специальные (сложные) – используют для тех микроорганизмов, которые не растут на простых средах: сахарный МПБ, сахарный МПА, сывороточный МПБ и МПА, кровяной МПА, асцитический МПБ;

в) элективные (избирательные) – используют для определенных видов; создаются оптимальные условия для этих видов, а другие виды не растут или растут плохо: щелочная ПВ (для холерного вибриона), среда Сабуро (для грибов), желточно-солевой агар (для стафилококка), сывороточные среды – среда Ру и среда Леффлера (для дифтерийных коринебактерий), среда Китта-Тароцци (для анаэробов), среды с желчью (для тифо-паратифозных бактерий), среды с глицерином (для микобактерий туберкулеза);

г) дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств и дифференцировки (отличия) одного вида микроорганизмов от другого по его ферментативным свойствам: среды Эндо, Левина, Плоскирева, среды Гисса. Состав сред подбирается так, чтобы выявить характерные отличия ферментативных свойств одного вида от другого.

Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, который его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет.

Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолетовый цвет.

Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрального красного, солей желчных кислот, минеральных солей. Эта среда также является элективной, т.к. подавляет рост многих микробов (кишечной палочки и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов).

Эти среды используются для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae. Они позволяют отличить патогенные микроорганизмы от кишечной палочки (см. лекцию №5)..

Среды Гисса служат для изучения сахаролитических свойствах микробов (см. лекцию №5

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: