Бутираты в каких продуктах

Наталья Резник,
кандидат биологических наук

«Химия и жизнь» №2, 2017

Это только в рекламе кишечные бактерии неизменно доброжелательны и заботливы. А на самом деле их метаболиты могут причинить своему хозяину ощутимый вред, например, вынудить его больше есть или подавить размножение стволовых клеток кишечника.

Клетки в окопах

Внутренняя поверхность кишечника, его слизистая оболочка не гладкая, это сложный рельеф из выростов (ворсинок) и углублений — либеркюновых крипт (рис. 1). Количество крипт, крошечных трубочек длиной 0,25–0,5 мм и диаметром до 0,07 мм, достигает 80–100 на 1 мм2. Названы они в честь немецкого анатома Иоганна Натаниеля Либеркюна, описавшего крипты в 1754 году. Правда, он был четвертым, кто это сделал, первенство принадлежит итальянскому врачу и биологу Марчелло Мальпиги (1628–1694), открывшему множество других структур, значительная часть которых получила его имя.

Хотя крипты известны почти 300 лет, ученые не вполне понимают, для чего они нужны. Известно, что в криптах находятся секретирующие клетки и стволовые клетки кишечного эпителия, но зачем все это прятать в ямки? В 1970-х годах возникло предположение, что крипты защищают стволовые клетки от повреждающих факторов, которые могут находиться в просвете кишечника: инвазивных, то есть проникающих в клетку, микроорганизмов и генотоксичных соединений. Однако проверили и подтвердили эту гипотезу совсем недавно. Специалисты Медицинской школы Университета Вашингтона под руководством профессора Тадеуша Степпенбека доказали, что крипты действительно защищают стволовые клетки. Опасаться им следует бутирата, который в больших количествах синтезируют кишечные бактерии (Cell, 2016, 165, 1–13, doi: 10.1016/j.cell.2016.05.018).

Итак, эпителий кишечника. Его клетки выстилают ворсинки, всасывают питательные вещества и выполняют некоторые другие функции. Эпителий постоянно обновляется благодаря делению стволовых и прогениторных клеток, расположенных на дне крипт. (Прогениторными называют клетки, которые еще не дифференцировались, но уже сделали первые шаги в определенном направлении.) Деление клеток, направление их дифференцировки и даже количество крипт находятся под генетическим контролем. Однако, помимо генов, на многие аспекты жизни хозяина — обмен веществ, иммунитет, развитие нервной системы и кровеносных сосудов — влияют бактерии, живущие в просвете его кишечника. У человека их примерно 100 триллионов. Известно также, что микробиота помогает кишечному эпителию восстанавливаться после повреждений, вызванных иммунными расстройствами. Осталось только выяснить, взаимодействуют ли микробные метаболиты со стволовыми клетками кишечника, и если да, то как.

Исследователи составили список из 92 молекул — продуктов метаболизма бактерий, населяющих кишечник обычных мышей. Действие этих молекул проверили на первичной культуре эпителия ободочной кишки. Культура содержит разные типы клеток, в том числе и стволовые. Скрининг позволил выделить восемь молекул, подавляющих клеточное деление в условиях, благоприятных для роста стволовых и прогениторных клеток. Самым сильнодействующим веществом оказался бутират — анион масляной кислоты; в концентрации 1 мМ он замедляет пролиферацию стволовых клеток, а при концентрациях 3–10 мМ его действие становится необратимым и может привести к апоптозу.

Бутират — продукт бактериальной ферментации пищевых волокон, один из наиболее распространенных микробных метаболитов, обнаруженных в кишечнике млекопитающих. В основном его синтезируют представители родов Clostridium, Eubacterium и Butyrivibrio. Его концентрация составляет около 5 мМ у мыши и примерно 70 мМ у человека. В таком количестве бутират должен поубивать все стволовые клетки и лишить кишечник эпителия. Однако не будем забывать, что настоящая слизистая оболочка кишечника, в отличие от клеточной культуры, рельефна. Исследователи предположили, что стволовые клетки спасаются от бутирата, как в норках, в глубине крипт. Но как это проверить?

Если стволовые клетки действительно находятся под защитой крипт, изменения концентрации бутирата в просвете кишечника не повлияют на их пролиферацию. Содержание бутирата можно уменьшить, заморив бактерии антибиотиками, или увеличить, делая мышам бутиратовые клизмочки. Биопсия, взятая после четырех дней воздействия, показала, что эпителиальные клетки прекрасно делятся вне зависимости от концентрации бутирата. Для сравнения ученые использовали рыбку данио, у которой кишечный эпителий обновляется очень быстро, а крипт нет. Правда, бактерий, синтезирующих бутират, нет тоже, и в рыбьем организме он не образуется. После того как личинок данио обрабатывали раствором бутирата, пролиферация клеток кишечника резко замедлялась. Ученые предположили, что это результат отсутствия крипт — стволовые клетки на поверхности кишечного эпителия оказались беззащитны. Контрольная обработка в растворе хлорида натрия на клеточное деление не влияла.

Как еще доказать, что крипты ограничивают доступ бутирата к стволовым клеткам? Исследователи вызвали у мышей язву кишечника, обработав его декстран-сульфатом. В местах действия реактива слизистая оболочка нарушена, крипты повреждены, стволовые клетки лишены защиты, и язва заживает медленно. Если ввести мышам-язвенникам антибиотик метонидазол, убивающий бактерии, которые производят бутират, язва затягиваться быстрее. Если мышам, получившим антибиотик, сделать клизму с бутиратом, заживление язвы замедлится даже в отсутствие бактерий.

Будем считать защитную роль крипт доказанной и зададим следующий вопрос: а почему, собственно, бутират не попадает в эти норки? Отчасти благодаря естественному градиенту концентрации, которая из-за диффузии меньше на дне крипты, чем в просвете кишечника. Кроме того, важную роль играют дифференцированные клетки эпителия, выстилающие поверхность кишечника. Эпителиальные клетки толстой кишки, которая, кстати, заселена микроорганизмами плотнее, чем любой другой орган, называются колоноцитами. Колоноциты сменяются быстро, раз в три-четыре дня, и занимают огромную площадь. Им требуется много энергии, а глюкозы там, где они находятся, уже мало, поэтому в качестве источника энергии колоноциты используют бутират. Впервые этот факт установили несколько лет назад сотрудники университета Северной Каролины (Cell Metabolism, 2011, 13, 517–526, doi: 10.1016/j.cmet.2011.02.018), теперь о нем вспомнили Тадеуш Степпенбек с коллегами. Сначала они поработали с клеточными культурами и убедились, что стволовые клетки бутират не окисляют, а колоноциты активно поглощают его из питательной среды. Если бутират присутствует в среде в концентрации, в два раза замедляющей деление стволовых клеток, колоноцитам достаточно потребить всего 30% вещества, чтобы восстановить нормальную скорость пролиферации. Никакого вреда бутират колоноцитам не причиняет.

От клеточных культур перешли к мышам. Когда животным ввели в кишечник бутират, помеченный изотопом углерода 13С, большая часть метки сконцентрировалась в колоноцитах на вершине крипт. Для усвоения бутирата необходим фермент ацил-КоА-дегидрогеназа. У мутантных мышей, лишенных этого фермента, зона деления стволовых и прогениторных клеток существенно меньше, чем у животных дикого типа. Добавление экзогенного бутирата усугубляет ситуацию. И язвы слизистой кишечника у таких мышей хуже зарастают.

Следовательно, колоноциты, как стражники на воротах, охраняют входы в крипты и не пропускают бутират внутрь, к стволовым клеткам (рис. 2).

Оказалось, что бутират блокирует пролиферацию, усиливая активность транскрипционного фактора Foxo3. Этот фактор работает в стволовых и прогениторных клетках и регулирует их деление. Активированный Foxo3 связывается с промоторами нескольких генов, подавляющих деление, их экспрессия возрастает, пролиферация замедляется. Стволовые клетки мутантных мышей, лишенных Foxo3, менее чувствительны к уровню бутирата в просвете кишечника.

Исследователи отмечают, что бутират оказался мощнейшим ингибитором пролиферации стволовых и прогениторных клеток. Его кратковременное действие не страшно и обратимо, долговременное может привести к серьезным последствием. Однако в этом есть глубокий смысл. При поврежденных колоноцитах, в случае язвы, например, бутират заблокирует деление стволовых клеток и не позволит им вступить в прямой контакт с генотоксичными соединениями, которые могут находиться в просвете кишечника. Если бы активно делящиеся прогениторные клетки устремились из мелкой, поврежденной крипты навстречу мутагенам, вероятность развития злокачественной опухоли была бы достаточно высокой.

Комментируя эту работу, доктор Хьюго Снипперт, молекулярный биолог Медицинского центра Утрехтского университета, подчеркивает, что взаимодействие микробиоты и хозяина в данном случае налажено благодаря сложной архитектуре слизистой оболочки кишечника (Cell, 2016, 165, 1564–1566, doi: 10.1016/j.cell.2016.06.003). Колоноцитам, которые находятся в постоянном контакте с бутиратом, он необходим, для стволовых клеток губителен, и они прячутся в крипты. Существует даже теория, согласно которой метаболиты кишечных симбионтов играют важную роль в эволюции хозяев. Однако влияние микробиоты на эволюцию крипт доказать пока сложно. Например, желудок и двенадцатиперстная кишка также держат свои стволовые клетки в криптах, но плотность микроорганизмов там куда меньше, чем в толстом кишечнике. Возможно, крипты защищают стволовые клетки и от других веществ и патогенов, не только от бутирата. Разные типы отбора могли привести к сходному результату, многие эволюционные задачи имеют сходное решение, и структура кишечного эпителия могла сформироваться под влиянием многих факторов.

Как бы то ни было, симбиоз между кишечным эпителием и его микробиотой куда сложнее, чем простое двустороннее взаимодействие. И конечно, он еще сложнее, чем описано в статье, посвященной лишь одному аспекту их отношений.

Интересно, что другие короткоцепочечные жирные кислоты, которые образуются в результате микробной ферментации, ацетаты и пропионаты, не влияют на деление стволовых клеток кишечника и колоноциты их не потребляют. Отсюда, однако, не следует, что эти вещества безобидны. Ацетат, например, представляет серьезную проблему, и защиты от него, в отличие от бутирата, нет.

Как микробы помогают растолстеть

Микробный ацетат способствует развитию метаболического синдрома. Механизм его действия установили специалисты Медицинской школы Йельского университета (США) и Копенгагенского университета под руководством профессора Джеральда Шульмана, который трудится в обоих научных центрах (Nature, 2016, 534, 213–227, doi:10.1038/nature18309).

Ученых подвигли на это исследование известные данные о том, что при переедании, ожирении и метаболическом синдроме изменяется состав кишечной микрофлоры и возрастают концентрации микробных ацетата, пропионата и бутирата. Но при этом неясно было, действительно ли эти кислоты влияют на ожирение или только ему сопутствуют, а если влияют, то каков механизм их действия. А если узнать механизм, можно воздействовать на процесс. Джеральд Шульман и его коллеги работали с самцами крыс, устойчивыми к инсулину и склонными к ожирению, и обнаружили, что при потреблении жирной пищи в плазме крови и фекалиях животных возрастают скорость образования и концентрация ацетата, но не пропионата с бутиратом. После трехдневного содержания на жирной диете уровень ацетата в плазме возрастает раза в полтора, четырехнедельная диета увеличивает его концентрацию в три раза. Ученые доказали, что этот ацетат имеет микробное происхождение. Для этого они использовали разные способы, все мы перечислять не будем, самыми гуманными и эстетичными были промывание кишечника солевым раствором и обработка антибиотиками. Каждая из антимикробных мер снижала продукцию ацетата на 75–95%.

Любая съеденная пища стимулирует секрецию инсулина, который регулирует распределение глюкозы по клеткам. Если дать крысе углеводную гранулу, уровень глюкозы в ее крови возрастет и бета-клетки поджелудочной железы выделят соответствующее количество инсулина. У животных, получавших жирную пищу, секреция инсулина в несколько раз выше, чем в контроле. Синтез инсулина можно нормализовать, если пролечить крыс антибиотиками. Прием антимикробных препаратов снижает секрецию инсулина в ответ на глюкозу на 70%. А если животным, получавшим обычный корм, ввести ацетат в артерии, синтез инсулина будет столь же высок, как при жирной диете.

Итак, микробный ацетат вызывает усиленную секрецию инсулина. Однако бета-клетки поджелудочной железы он не стимулирует: при взаимодействии с ацетатом их биохимическая активность остается неизменной или даже слабеет. Известно, что секреторную деятельность бета-клеток регулирует парасимпатическая нервная система, в частности блуждающий нерв, поэтому естественно было предположить, что ацетат каким-то образом воздействует на него. Маркером парасимпатической активности служит концентрация гастрина в плазме. Гастрин — гормон желудка и поджелудочной железы, его секреция возрастает в ответ на стимуляцию желудка блуждающим нервом. Если ввести в крысиные артерии ацетат, концентрация гастрина увеличивается в три раза, и это еще один повод обратить внимание на блуждающий нерв. (О его взаимодействии с кишечной микробиотой мы уже писали, см. «Химию и жизнь» № 6, 2012.)

Для стимуляции парасимпатической нервной системы ацетат должен попасть в мозг, и ученые доказали, что из крови он туда действительно проникает. Чтобы убедиться, что ацетат именно оттуда командует парасимпатической системой, его ввели непосредственно в мозг в такой же концентрации, в какой он, согласно расчетам, должен поступать в этот орган из плазмы крови. В результате инсулиновый ответ на глюкозу стал в три раза сильнее. Следовательно, ацетат действительно влияет на синтез инсулина через центральную нервную систему.

Желая убедиться, что ответ на ацетатный сигнал проходит из мозга именно по блуждающему нерву, исследователи его перерезали. Эта процедура называется ваготомией. У ваготомированных крыс введение ацетата вызвало примерно четырехкратное сокращение концентрации инсулина в плазме по сравнению с контролем. Значит, ученые оказались правы. Они приводят множество других доказательств, мы их здесь опустим, не будем утомлять читателя.

Теперь, когда исследователи выяснили механизм действия ацетата, им осталось убедиться, что он действительно вызывает ожирение. Для этого крысам в течение десяти дней вводили в желудок ацетат. Кормили животных обычным кормом, но ацетат создавал иллюзию микробного расщепления избытка жиров. Крысы при таком режиме усиленно секретировали инсулин, содержание гастрина в плазме возрастало в пять раз. Животные съедали за день вдвое больше, чем контрольные, и, в отличие от них, прибавили в весе процентов на десять. Возможно, этот эффект отчасти связан с трехкратным увеличением концентрации грелина в плазме. (Грелин — гормон, вызывающий чувство голода.) Ваготомия сводит на нет действие ацетата.

Кольцо доказательств наконец замкнулось (рис. 3). Кишечные бактерии жирно едящих крыс активно синтезируют ацетат, который попадает в мозг и активирует парасимпатическую систему, что вызывает усиленную секрецию инсулина и грелина. Возникает порочный круг: чем больше инсулина выделяется, тем быстрее клетки усваивают всю глюкозу, ее концентрация в плазме падает, выделяется грелин, и тело хочет есть. Если речь идет о кратком переедании, ситуация быстро придет в норму, но, когда она становится хронической, избыток поглощенных жиров откладывается в печени и скелетных мышцах, они приобретают устойчивость к инсулину, а там рукой подать до ожирения и метаболического синдрома.

Как водится, в конце работы исследователи пишут, что для изучения всех возможных физиологических эффектов ацетата и других микробных метаболитов необходимы дальнейшие исследования. А уже обнаруженный механизм — усиленная продукция ацетатов под влиянием жирной пищи и последующая активация парасимпатической нервной системы — может послужить мишенью для лечения ожирения.

Но если ацетат действительно так действует, то как быть любителям маринадов и приверженцам оздоровления яблочным уксусом?